溪黄草水提物对酒精性肝损伤的保护作用研究

叶秋莹 张黎黎 黄自通 许佳鑫 李元栋 吴泰逸 黄 辉 林冰淇 林妙倩

清远职业技术学院食品药品学院，广东 清远 511500

1 材料

1.1 材料

1.1.1 药品与试剂 溪黄草(Rabdosia serra (Maxim.) Hara)(湖北金贵中药，批号：A180301)、联苯双酯滴丸药品(广州白云山星群药业，批号：NF40005)购于阳光大药房；谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)、丙二醛(MDA)测定试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。

1.1.2 实验动物 昆明小鼠，SPF级，雄性，体重18～22 g，均于南方医科大学实验动物中心采购，小鼠生产许可证号SCXK(粤)2016-0041。实验条件温度保持为20～25 ℃，相对湿度在40%～70%，饲养3 d后进行实验。

2 方法

2.1 溪黄草水提液的制备 称取6 g的溪黄草，加100 mL水，浸泡1 h，加热煮沸，煮沸开始计时1 h，稍冷，用四层纱布过滤得中药水煎液①。重复上述过程，用四层纱布过滤得中药水煎液②。合并滤液，浓缩至20 mL，得质量浓度为 0.6 g/mL(以生药量计)的药液，置于 4 ℃冰箱中密封保存[8]。

2.2 动物分组造模及给药 将48只SPF级健康雄性昆明小鼠随机分为空白组、模型组(酒精：52°白酒)、阳性组(药物：联苯双酯滴丸，200 mg/kg)、溪黄草组(6 g生药/kg)4组，每组12只。每日空白组、模型组小鼠按0.1 mL/10g给予蒸馏水，阳性组、溪黄草组小鼠按0.1 mL/10 g灌胃给药，1次/d，共10 d。每次给药后1 h，除空白组外的其余各组小鼠按0.1 mL/10 g灌胃给予52°白酒造模，1次/d，共10 d。

2.3 样本的采集 实验结束末(实验前禁食12 h，自由饮水)，小鼠眼球取血，离心分离血清，-20 ℃ 保存备用，之后颈椎脱臼处死小鼠，立即摘取肝脏，用预先冰浴灭菌的生理盐水洗净，滤纸吸干，称取肝脏湿重，摊开进行拍照。取剩余部位组织若干块，分别置10 mL EP管中，保存于-20 ℃备用。

2.4 指标观察及测定方法

2.4.1 动物的日常情况 实验期间每天观察小鼠的行为活动、摄食、毛发、饮水及精神状态等情况，做好观察记录。

2.4.2 肝脏形态及肝脏指数的计算 脱臼处死并解剖小鼠后，肉眼观察并分析小鼠肝脏的病变情况(包括色泽、形态等)。

中国城市化进程即中国农村转化成城市的过程。19世纪下半叶到20世纪中后期，中国城镇化基本处于停滞状态；改革开放以后，进程加快，最显著的成就是中国城镇化水平从1978年的17.92%提升到2016年的57.35%。城镇化进程加快，意味着越来越多的农村人口转变为城市人口或者半城市人口，意味着农村人口的生活方式、消费方式也逐渐趋向城市居民。代表着先进、文明、便利、舒适的城市消费文化对当代农民，尤其是农村青年产生了巨大的吸引力。这种无法抗拒的吸引力也逐渐在农村青年的婚姻生活打上了深深的烙印。

2.4.3 生化指标的检测 取出存于-20 ℃的小鼠血清，梯度解冻，用试剂盒测试。按照试剂盒操作方法测定血清和肝脏中谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase, ALT)、谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase, AST)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性及丙二醛 (MDA)的含量。

3 结果

3.1 溪黄草水提液对小鼠体重、肝脏重量、肝脏指数及一般情况的影响 实验期间对小鼠进行一般体征观察，空白组小鼠在摄食与饮水方面正常，毛色光亮，活动正常，其余各组均出现摄食与饮水量略有减少的现象，其中模型组小鼠毛色不光泽，行动略迟缓。除了空白组，给予其余各组小鼠52°白酒后，均出现不同程度的醉酒现象：反应迟钝、流涎、四肢瘫软、步履不稳、嗜睡等，有部分小鼠出现前爪挠嘴的现象，甚至伴随呼吸急促。在给予药物后，阳性对照组和溪黄草组可逐渐恢复正常。

与空白组小鼠相比，各组小鼠体重显著下降(P<0.05)，其中溪黄草组下降最为显著(P<0.01)；模型组的肝脏重量略有增加，通过肝脏系数计算公式得出的，其肝脏指数显著增加(P<0.05)，表明酒精造成的肝损伤会使得肝细胞肿大；与模型组相比，阳性对照和溪黄草组均显著降低(P<0.05)，说明两者药物均可以缓解小鼠肝脏受损情况。结果见表1。

表1 溪黄草对小鼠体重、肝脏重量及肝脏指数的影响

3.2 肝脏形态的肉眼观察 空白组的小鼠肝脏形态正常，肝色鲜红，包膜光滑，湿润，有弹性，且边缘锐利(小框所示)、质韧，无病变现象；模型组的肝脏外观主要表现为灰黄色点状坏死灶，肝色暗沉，包膜略光滑，边缘变钝(小框所示)，质地变软，易碎，切面略带油腻感，说明酒精所致小鼠急性肝损伤造摸成功；与模型组比较，阳性对照组和溪黄草组的病变现像有所改善，肝色偏鲜红，略湿润，弹性增加，边缘组织钝化不明显(小框所示)，而且两组间外观观察，无明显的区别，说明溪黄草对急性酒精性肝损伤有一定的改善作用。结果如图2所示。

图2 肉眼观察小鼠肝脏组织的大体情况

3.3 溪黄草水提取物对肝脏、血清中肝功能指标的影响 与空白对照组比较，急性酒精性肝损伤小鼠肝脏、血清ALT、AST含量均显著增加，提示造模成功；与模型组比较，阳性组和溪黄草组的ALT、AST含量显著降低(P<0.01)，提示溪黄草水提物能改善急性肝损伤的肝功能指标水平。结果见表 2、3。

表2 溪黄草水提物对ALD小鼠肝脏组织的ALT、AST水平的影响

表3 溪黄草水提物对ALD小鼠血清的ALT、AST水平的影响

3.4 溪黄草水提物对ALD小鼠的抗氧化水平的影响 酒精会在人体的新陈代谢中产生大量的活性氧(ROS)，影响机体的抗氧化系统，导致酒精性肝损伤，而体内的抗氧化剂会保护细胞免受活性氧的影响，但这些抗氧化剂的活性很容易被过量的脂质过氧化物清除，导致肝脏损伤[9]。与空白组相比，模型组小鼠肝脏、血清中的谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)和超氧化物歧化酶(SOD)活性均显著下降，而自由基作用于脂质过氧化的产物丙二醛(MDA)含量显著上升(P<0.01)，这表明酒精引起小鼠肝脏中过氧化物水平的显著增加，并且抗氧化能力下降，提示造模成功。阳性对照组、溪黄草组能够显著提高ALD小鼠肝脏、血清中GSH-px、SOD的活性(P<0.05)，不同程度地降低MDA的含量(P<0.05)，提示溪黄草水提物能促进GSH-px、SOD的活性，有效防止酒精摄入引起的小鼠肝细胞过度氧化，增强机体抗氧化能力，且能不同程度的降低MDA的含量。结果见表4、5。

表4 溪黄草水提物对ALD小鼠肝脏组织的SOD、GSH-px、MDA水平的影响

表5 溪黄草水提物对ALD小鼠血清的SOD、GSH-px、MDA水平的影响

4 讨论

经胃肠道吸收的酒精90%～98%在肝脏中通过乙醇脱氢酶途径、微粒体乙醇氧化系统、过氧化氢酶系统这3个途径进行代谢。在这氧化代谢过程中，产生的大量自由基介导了肝细胞内氧化应激反应，增加了体内的氧化水平，当肝细胞中的氧化水平超过抗氧化水平时，就会破坏肝脏的细胞膜脂质导致肝细胞坏死[10]。ALT、AST是肝细胞损伤的标志，肝细胞损伤时，细胞膜破坏，细胞通透性增加，使肝细胞中的 ALT 与AST进入血液进而引起血清中ALT 与AST的升高[11]。机体内存在包括 SOD 等酶类及包括还原型谷胱甘肽(GSH-px)等非酶类两大抗氧化防御体系，以清除氧自由基，阻断组织过氧化损伤；MDA 是活性氧自由基氧化生物膜过程中产生的脂质过氧化产物，其水平的高低与氧化应激对肝脏的损害程度相关[12-13]。溪黄草唇含有二萜类、黄酮类等重要的有效成分，而二萜类化合物经过药理筛选证实其具有抗肿瘤、抗菌、抗氧化、抗炎等多种生物活性，其作用机制与肝脏线粒体的保护、肝脏内源性抗氧化系统的调控相关；黄酮类物质具有抗氧化、抗肿瘤、抗病原微生物等药理活性，对肝脏损伤有较好的保护作用[14-15]。

本实验对溪黄草水提物进行了保肝作用及机制的研究，结果初步显示，与空白组比较，模型小鼠体肝脏明显肿大，血清ALT、AST 水平增加，肝指数增大，肝组织MDA含量显著增加，SOD、GSH-px 活性显著降低，提示模型小鼠肝功能受损且可能存在脂质过氧化反应，同时也说明造模成功。给予溪黄草水提物进行干预，能有效拮抗模型小鼠肝脏质量增加，降低肝组织 MDA 水平，提高 SOD、GSH-px 活性，改善肝肿大；肝组织外观观察显示，溪黄草水提物组小鼠肝脏受损情况改善明显，可减轻肝脏病变状态，逐渐恢复接近阳性对照组的肝脏情况。而且溪黄草组小鼠体重显著减少，由此可以推测溪黄草通过调节机体氧化酶系统影响了脂肪代谢途径，这可能是预防急性肝损诱发脂肪肝的保护机制。因此认为溪黄草能抑制肝功能指标水平的上升、保护肝细胞以及有效改善肝功能，为防治急性酒精性肝损伤的作用机制之一[16-18]。此外，本实验结果也证实溪黄草水提物可增强GSH-px、SOD活性并阻止酒精引起的MDA升高，从而降低氧化应激所引起的肝细胞损伤，结果提示，抗氧化作用可能是溪黄草水提物对ALD小鼠急性肝损伤的保护作用机制之一。

综上，溪黄草水提物护肝机制主要是通过降低机体的氧化应激反应，抑制肝功能指标水平的增加，改善肝脏病变情况，也将为深入研究其保肝通路机制奠定实验基础。