土壤源孔雀石绿脱色菌的筛选及脱色条件分析

廖华媛，熊梦霞，李润成

（湖南农业大学动物医学院，长沙 410128）

孔雀石绿（Malachite green；MG）是一种三苯甲烷染料，被广泛用于工业生产中，同时还被作为抗菌剂用于水产养殖，直到1993 年被美国食品和药物管理局（FDA）列为致癌性化学物［1，2］。但由于MG 的低成本和高效性［3］，其仍被非法使用，并在鱼组织和养殖用水中检测到有MG 残留［4，5］。此外，MG 拥有独特化学结构的孔雀石绿，其在环境中降解周期长，难以根除［6］。因此，如何安全有效地降解环境中的孔雀石绿成为亟待解决的难题。

一些物理化学技术，如吸附、氧化（过氧化氢、臭氧）、电化学处理已用于去除废水中的孔雀石绿并取得一定的效果，但存在成本高、效率较低或产生二次污染等问题［7］。而微生物法是目前最安全、有效及普遍的使用方法［8］。目前已报道的能降解孔雀石绿的细菌主要有气单胞菌属［9］、假单胞菌属［10］、肠杆菌属［11，12］及芽孢杆菌属［13］等。本研究以孔雀石绿为目标染料，对11 株不同种的土壤分离菌进行筛选，结果得到了1 株能有效降解高浓度孔雀石绿的菌株，并对其脱色性能及孔雀石绿经其降解后对细菌的毒性进行了初步研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 11 株土壤分离菌均源自湖南农业大学校园内，保存于湖南农业大学动物疫病分子与免疫学实验室。菌株编号及各菌株的16S 测序鉴定情况见表1。

表1 11 株不同种土壤分离菌信息

1.1.2 培养基 LB 固体培养基：蛋白胨10.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，氯化钠10.0 g/L，琼脂粉15.0 g/L；LB 液体培养基：蛋白胨10.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，氯化钠10.0 g/L。

1.1.3 主要试剂及仪器 电热恒温培养箱，上海经鸿实验设备有限公司生产；全温度光照振荡培养箱，上海知楚仪器有限公司生产；连续酶标波长仪SpectraMax M5，美国Molecular Devices 公司生产；孔雀石绿［（C23H25N2）2·2H2C2O4，相对分子质量926.98］为化学纯，购自广州化学试剂厂。

1.2 方法

1.2.1 菌株的筛选 将11 株菌株按1% 接种到3 mL LB 液体培养基中，37 ℃、180 r/min 培养24 h，将各菌培养液按OD600nm调至相同浓度后，各取3 μL 滴在含300 mg/L 孔雀石绿的LB 平板中央，放入37 ℃温箱培养24 h。能使含MG 的LB 琼脂颜色消失或变淡的菌株被认为其对孔雀石绿有脱色降解作用［14，15］，并作为下一步研究的目标菌株。

1.2.2 目标菌株对孔雀石绿脱色降解效能的测定用500 mL 的锥形瓶配制100 mL 分别含300、400、500、600、700、800、900、1 100、1 300 mg/L 孔雀石绿的LB 培养基（pH 7），在染料培养基中按1%（V/V）接种量接入菌株S1-2，于37 ℃、180 r/min 培养，每隔12 h 取500 μL 离心，取上清200 μL 测定OD622nm。不发生脱色反应则取培养液接种，考察细菌生长是否被抑制。

1.2.3 脱色降解处理后MG 溶液对细菌毒性的检测 降解处理后MG 溶液对细菌毒性检测采用牛津杯法［16］。以在含MG 的LB 平板中不生长的菌株S2-4（解淀粉芽孢杆菌）、A15（壁芽孢杆菌）作为受试菌种。所用细菌在37 ℃培养12 h，复苏后，每个菌株取100 μL 分别涂布至牛津杯中含100 μL 300 mg/L MG 的LB 平板，及牛津杯中含100 μL 降解处理后MG（试验“1.2.2”中300 mg/L MG 经处理后的产物，离心取上清液并过滤除菌）的LB 平板，每个处理1 次重复。各接种物37 ℃培养10 h 后测定抑菌圈的直径（抑菌圈直径-牛津杯直径），脱色降解前后孔雀石绿对细菌的毒性通过抑菌圈的直径大小反映。

式中，Db为孔雀石绿降解前抑菌圈的直径；Da为孔雀石绿降解后抑菌圈的直径。

1.2.4 目标菌株发挥脱色降解MG 作用的条件分析

1）种子菌液的培养。将对MG 具有脱色降解作用的菌株接种于含10 mL LB 液体培养基（pH 7）的50 mL 离心管中，于37 ℃、180 r/min 条件下，培养至OD600nm为0.80～0.90 作为种子菌液。

2）不同接菌量对菌株脱色降解MG 作用的影响。 在10 mL 含300 mg/L MG 的LB 培养基（pH 7.0）中按0.5%、1.0%、3.0%、5.0%、7.0% 接菌，37 ℃、180 r/min 培养9 h 后，每隔2 h 取500 μL 培养物进行离心（8 000 r/min、5 min），取200 μL 上清液，测定OD622nm，直至培养23 h 结束测定。

3）初始培养液pH 对菌株发挥MG 脱色降解作用的影响。用HCl 和NaOH 将10 mL 含300 mg/L MG 的LB 培养基的初始pH 分别调为3、4、5、6、7，按1%（V/V）接入目标菌株，37 ℃、180 r/min 培养9 h后，每隔2 h 取500 μL 培养物进行离心，再每孔取200 μL 上清液，测定OD622nm，直至培养23 h 结束测定。不发生脱色反应则取培养液接种，考察细菌生长是否被抑制。

4）培养温度对菌株发挥MG 脱色降解作用的影响。在10 mL 含300 mg/L MG 的LB 培养基（pH 7）中按1%（V/V）接种量接入目标菌株，分别放置在20、25、30、35、40 ℃，180 r/min 培养9 h 后，每隔2 h取500 μL 培养物进行离心，取200 μL 上清液测OD622nm，直至培养23 h 结束测定。不发生脱色反应则取培养液接种，考察细菌生长是否被抑制。

5）盐浓度对菌株产生脱色降解MG 作用的影响。在10 mL 分别含NaCl 浓度为6、8、10、12、14、16、18 g/L MG（300 mg/L）的LB 培养基中，按1%（V/V）接种目标菌株，37 ℃、180 r/min 培养9 h 后，每隔2 h取200 μL 培养物进行离心，测定OD622nm，直至培养23 h 结束测定。不发生脱色反应则取培养液接种，考察细菌生长是否被抑制。

6）孔雀石绿脱色降解率的计算。参照文献［18］进行孔雀石绿脱色降解率的计算，取培养液以8 000 r/min 离心5 min，在孔雀石绿最大吸收波长622 nm处测定上清液的吸光度，以相同MG 浓度不接菌的溶液作为对照，取2 个平行处理的平均值计算脱色率。以脱色率来表示菌株对孔雀石绿的脱色能力。

式中，A0表示不接菌溶液的吸光度；At表示接菌培养t 时间后溶液的吸光度。

1.3 数据处理

数据采用Excel 2010 和GraphPad Prism 6 软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 菌株的筛选

11 株土壤分离菌在含MG（300 mg/L）的LB 平板中37 ℃恒温箱培养24 h 后观察，结果（图1）表明，阴沟肠杆菌（S1-2）、铜绿假单胞菌（6-1）菌苔周围MG 脱色明显，但菌株S1-2 脱色面积更大，因此，确定S1-2 为下一步研究的目标菌株。此外，菌株S2-4、A15 在平板中不生长，因此将这2 株菌作为脱色降解处理后MG 溶液对细菌毒性检测的受试微生物。

图1 菌株S1-2、6-1 在孔雀石绿LB 平板中的脱色分解情况

2.2 目标菌株对孔雀石绿脱色降解效能的测定

配制MG 初始质量浓度300～1 300 mg/L LB 培养基以测定目标菌株对MG 的降解效能，各浓度MG 降解结果见表2、图2。由表2 可见，菌株S1-2在12 h 内对300 mg/L MG 的脱色率为94.19%；在24 h 内对400～900 mg/L MG 的脱色率为95.95%～96.80%；36 h 内 对1 100 mg/L MG 的 脱 色 率 为96.72%；菌株S1-2 培养至48 h 对1 300 mg/L MG仍无脱色，结果取10 μL 该组培养液涂布在普通LB平板中，只有少量细菌生长，说明菌株生长受到明显抑制。

表2 菌株S1-2 对MG 的脱色率 （单位：%）

图2 菌株S1-2 降解MG 的颜色变化过程

2.3 孔雀石绿经S1-2 菌株脱色后对细菌毒性的检测

以在含MG 的LB 平板中不生长的菌株S2-4（解淀粉芽孢杆菌）、A15（壁芽孢杆菌）为受试微生物，抑菌试验结果见表3 和图3。由表3 可知，在牛津杯中加入100 μL MG（300 mg/L），对菌株S2-4、A15 的抑菌圈直径分别为（22.40±5.00）mm、（21.60±2.20）mm；在牛津杯中加入100 μL 处理后，MG（降解前浓度为300 mg/L）的抑菌圈分别为（10.80±1.90） mm、（9.50±2.00） mm；毒 性 分 别 降 低 了48.21%、43.98%。结果表明，孔雀石绿经菌株S1-2脱色降解处理后，毒性有一定程度的降低。

表3 孔雀石绿脱色后对细菌生长的抑制作用

图3 孔雀石绿脱色前后对细菌的毒性测试结果

2.4 目标菌株发挥脱色降解MG 作用的条件分析

2.4.1 不同接菌量对菌株发挥MG 脱色降解作用的影响 接菌量（0.5%～7.0%）对MG 脱色降解的影响见图4。由图4 可知，培养9～15 h，接种量对孔雀石绿脱色的影响较明显，即接种量与降解率呈负相关。9～15 h 内，同等培养时间下，0.5% 接种量的降解体系脱色率最高，达59.9%～83.89%；培养23 h 后，各接种量的脱色率接近一致，为91.67%～93.91%。

图4 不同接种量对菌株S1-2 脱色的影响

2.4.2 培养基初始pH 对菌株产生MG 脱色降解作用的影响 将菌株在pH 3～7、含MG 的培养基进行培养，pH 对菌株发挥MG 脱色降解作用的影响见图5。培养基初始pH 为3～5 时，菌株未能产生脱色作用，取10 μL 培养液涂布在普通LB 平板中，结果仅少量细菌生长，说明菌株生长受到明显抑制；当pH为6、7 时，培养23 h 后，菌株对孔雀石绿的脱色率分别为90.02%、94.54%。综上所述，菌株S1-2 不耐酸，仅在pH 为6、7 时才能发挥MG 脱色降解作用。

图5 培养基初始pH 对菌株S1-2 脱色的影响

2.4.3 培养温度对菌株产生脱色降解MG 作用的影响 温度能影响细菌的生长代谢，从而影响菌株脱色降解MG 的效率。温度（20～40 ℃）对菌株S1-2脱色的影响见图6。 由图6 可知，当温度为20～35 ℃，培养9～17 h，脱色率随着温度的升高而增大，同等培养时间下，35 ℃时脱色率达到最高，为71.26%～92.01%；当温度为40 ℃，培养9～13 h 时，脱色率在同等培养时间下较20～35 ℃低，为35.41%～40.05%。脱色体系在20～40 ℃培养23 h 后脱色率为84.61%～94.56%，说明该菌能在较大温度范围内脱色降解MG。

图6 培养温度对菌株S1-2 脱色的影响

2.4.4 盐浓度对菌株脱色降解MG 的影响 盐浓度（6～18 g/L）对菌株脱色的影响见图7。由图7 可知，MG 降解体系培养19 h，盐浓度对孔雀石绿降解有明显影响，盐浓度与脱色率呈负相关，盐浓度为6～8 g/L 时，脱色效果最明显；培养至23 h 时，各盐浓度的脱色率接近一致，为91.85%～93.77%，说明该菌具有一定的耐盐能力。

图7 盐浓度对菌株S1-2 脱色的影响

3 小结与讨论

孔雀石绿作为三苯甲烷染料之一，具有高毒、高残留、致癌和致突变等毒性作用［19］。以微生物降解为基础的生物修复技术是处理环境中孔雀石绿的有效方法之一。本研究中筛选得到的阴沟肠杆菌对高浓度孔雀石绿有较强的脱色分解能力，36 h 内完全降解1 100 mg/L MG。Du 等［8］在活性污泥中分离到一株假单胞菌属YB2，在最适pH 及温度下，24 h 内对1 500 mg/L 孔雀石绿的分解率为90.40%，12 h 内能完全分解1 000 mg/L 孔雀石绿；Lv 等［17］研究表明，耐辐射球菌R1 能在30 min 中降解97.2% 的200 mg/L MG，但菌株的接种量较大（湿重菌接种量为8.0 g/L），通过比较说明本次筛选得到的菌株S1-2 能降解较高浓度的孔雀石绿。当MG 浓度达1 300 mg/L 时细菌被抑制生长，可能是由于MG 本身作为一种抗菌剂，对菌株具有毒性，浓度越高对细菌的毒害越大。

MG 脱色降解前后对菌株解淀粉芽孢杆菌、壁芽孢杆菌的毒性测试结果表明，经降解后的MG 对敏感菌抑制率降低了43.98%～48.21%。说明菌株阴沟肠杆菌降解孔雀石绿后，脱色降解产物的毒性在一定程度上有所降低［20，21］。

目标菌株产生脱色降解MG 的作用条件分析发现，菌株阴沟肠杆菌接菌量在0.5%～7.0%，接种量与MG 降解率呈负相关，推测当接种量为0.5%～7.0%时，接种量越小，单个细菌可利用的营养物质越多，细菌繁殖、代谢相对更旺盛，繁殖的代数也更多，因此低接种量的降解体系在短时间内的MG 降解率较高。

pH 可以通过改变微生物表面的电荷影响微生物对营养物质的吸收，也可通过改变蛋白质结构影响蛋白功能的发挥［22］，且文献［23，24］报道MG 在碱性环境中易发生沉淀而退色，本研究预试验同样发现，pH 为10、11 时，MG 可自动出现明显脱色，因此在研究培养基初始pH 对菌株脱色降解MG 影响时只设置了pH 3～7。结果证明菌株阴沟肠杆菌在pH 3～5 生长受到抑制，在pH 6、7 条件下，培养23 h能脱色降解90.02%～94.54% 的300 mg/L MG，说明该菌不耐酸。

菌株阴沟肠杆菌在20～40 ℃培养23 h，对MG脱色率在84.61% 以上。 文献［12］中Enterobacter sp. B-20 在25～40 ℃对MG 降解率在75% 以上，而菌株阴沟肠杆菌同为肠杆菌属，MG 降解体系在20～40 ℃的降解率达84.61% 以上，相比之下菌株阴沟肠杆菌发挥作用的温度范围更大，说明该菌在温度跨度较大范围内同样具有对孔雀石绿脱色降解的能力。

氯化钠在染织过程中提供的离子作用力能将染料印在待染色的织物上，同时也能将未与织物结合的染料释放到废水中。菌株阴沟肠杆菌在6～18 g/L NaCl 环境中，培养23 h 后脱色降解率达91.85%～93.77%。说明该菌具有一定的耐盐能力，而对盐具有一定耐受的菌株在处理染料废水过程中具有重要作用。

综上所述，阴沟肠杆菌能脱色降解较高浓度MG，对盐浓度有一定的耐受性且作用温度范围较广，具有修复染料废水的应用前景。