白及组培苗繁育技术研究进展

戴艳娇，贺爱国，陈 锦，宗锦涛，易力雄，陈 颐，熊邵军

（1. 湖南省农业环境生态研究所，湖南 长沙 410125；2.湖南省农业科学院，湖南 长沙 410125；3.云南省烟草农业科学研究院，云南 昆明 650021； 4.湘西土家族苗族 自治州农业科学研究院，湖南 吉首 416000）

白及[Bletilla striata（Thunb. ex A. Murray）Rchb. f.]又名白芨，是兰科白及属植物，为2015 版药典中药材白及的基源植物，具有收敛止血、消肿生肌的功效。因为应用范围广泛，白及又被列入《可用于保健食品的物品名单》和《化妆品原料目录清单》[1]。早年间，白及药材主要依赖于野生资源采挖，由于其自然繁殖周期长、繁殖率低、难度大，被《国家重点保护野生植物名录》（第2 批）列为二级保护植物[2]。为防止野生资源进一步遭到破坏，同时保证白及市场需求，目前主要采用组织培养的方式进行白及种苗繁育。白及种子、假鳞茎、侧芽、幼根和叶片均可作为组织培养的外植体，又因白及蒴果种子量大、可获得种苗多、萌发时间短、形成从芽率高等优势[3]，生产上多利用白及种子作为外植体进行育苗。白及种子作为外植体的组织培养过程通常分为种子萌发及原球茎诱导阶段（又可细分为种子萌发诱导和继代培养2 个阶段[4]）、原球茎增殖分化阶段、壮苗生根阶段和炼苗移栽。笔者综述了以上4 个阶段目前取得的研究进展，并分析了其中存在的问题，旨在为今后白及组培繁育技术的研究提供参考。

1 白及组培苗繁育技术研究进展

1.1 种子萌发及原球茎诱导

目前，大部分利用白及种子作为外植体的研究所用材料多为成熟未开裂的白及种子[4-5]。熊丙全等[6]研究发现，进行液体悬浮培养时，与成熟种子相比，采用近成熟的白及种子为材料可显著提高萌发率，缩短原球茎生产时间（15 d 左右），能在75～90 d 内成苗移栽，且操作程序简单，可有效降低育苗成本。液体培养基[7]和固体培养基均可用作白及种子萌发，其中固体培养基应用较为广泛。

种子萌发及原球茎诱导阶段的无菌环境是种子萌发的重要基础和前提条件。研究表明，5%的氯酸钠溶液或5%的过氧化氢溶液消毒15 min 均可保证外植体污染率小于5%，且消毒时间超过15 min 后，污染率受时间影响变化不大[4]。此外，氯化汞消毒和乙醇消毒也是常用的消毒方式[8]，消毒时间均以10 min 为宜[9-10]。时间过短消毒不彻底、污染率高，时间过长则会对种子活性造成影响，导致萌发率降低、长势差[9]。

种子萌发时的生态环境也至关重要。通常白及种子的萌发温度为25±2℃[10]，光照强度为1 800～ 2 500 lx，光照时间为12 h[4-5]。朱秀蕾[11]用红蓝光比为1 ∶1 的LED 光源处理白及组培播种苗，发现白及种子萌发时间较对照组白光处理缩短5 d，该发现可有效缩短白及种子的培养周期，降低成本。

除环境因子外，组培中种子萌发还与培养基的营养条件、外源激素水平密切相关。使用MS 培养液（无肌醇，无水氯化钙和硝酸钾含量均减半）+ 20 g/L 马铃薯泥+ 20 g/L 蔗糖的培养基，紫花三叉小白及的种子萌发诱导率可达95%[12]。萘乙酸（NAA）和6-苄氨基嘌呤（6-BA）是种子萌发时常用的植物激素。对于紫花白及而言，在MS 培养基中单独添加 1.0 mg/L 6-BA 有利于种子萌发，萌发率为94%，而单独添加1.0 mg/LNAA 后萌发率仅为47%，显著低于添加6-BA 的萌发率[4]；相反的观点则认为在1/2MS 培养基中单独添加 1.0 mg/L NAA 更利于种子萌发，萌发率为98%，而单独添加1.0 mg/L 6-BA 的萌发率为90%[5]。2 个研究中种子萌发过程中的光照、温度、培养时间相似，得出结论却完全相反，其可能原因之一是试验材料不同，一个为紫花白及，另一个则为白及；此外，2 个试验中添加6-BA 后的萌发率均较高且相差不多（94%和90%），可能是试验间系统误差导致的差异；但添加NAA 后的萌发率却相差近2 倍（47%和98%），可见种子萌发诱导阶段培养基中添加NAA 效果并不稳定，而添加6-BA 不但效果稳定且萌发率高。也有在此阶段将6-BA 和NAA 搭配使用的研究，如张燕 等[13]在1/2 MS 培 养基 中添 加5.0 mg/L 6-BA 和0.2 mg/L NAA，可使增殖倍数达2.71；刘敏等[10]在1/2 MS 培养 基 中 添 加1.0 mg/L 6-BA 和0.1 mg/L NAA，也得到了较好的增殖效果。值得注意的是，在6-BA和NAA 搭配使用的过程中，6-BA 用量远大于NAA，综合各激素单独使用的试验结果，笔者认为6-BA 比NAA 对白及种子萌发及原球茎诱导的效果更好。

1.2 原球茎增殖分化

种子萌发形成原球茎后，原球茎增殖倍数越高，繁育所得种苗越多。前人研究中增殖系数最高为14.2，其培养基为MS 培养液（无肌醇，无水氯化钙和硝酸钾含量均减半）+ 50.0 g/L 马铃薯泥+20.0 g/L 香蕉泥+0.4 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+25.0 g/L 蔗 糖+2.0 g/L 艾蒿叶干粉[12]；其次为10.0 倍，培养基为1/2 MS+1.5 mg/L N-苯基-N'-1,2,3-噻二唑-5-脲+3.0 g/L活性炭 + 50.0 g/L马铃薯泥+30.0 g/L蔗糖[14]。刘敏等[10]用添加了50.0 g/L 马铃薯泥的培养基得到增殖倍数为5.27，而用无马铃薯泥的培养基，增殖倍数仅2.80[5]。这说明马铃薯添加物对白及原球茎增殖具有重要作用。江本利等[15]通过正交试验对原球茎增殖液体培养基中的马铃薯汁浓度、KT 浓度和MS 培养基浓度进行分析，发现在这3 个因素中，马铃薯汁浓度对原球茎增殖率、增重率和粒径的影响均最大。杨平飞等[9]的研究也发现在其他添加物相同的条件下，有马铃薯添加物的培养基所培养的白及丛生芽幼苗和球径均大于无马铃薯添加物的培养基。由此可见，马铃薯添加物中含有利于白及原球茎增殖的某类或某几类物质，其具体成分有待进一步研究。

除马铃薯添加物外，植物激素对原球茎的增殖分化同样具有重要作用[16-17]。黄颖融等[18]认为NAA 是影响白及试管球茎膨大的主要因素，随NAA 浓度升高，原球茎的鲜重增殖率、直径增殖率和高度增殖率逐渐增加，当NAA 浓度为1.0 mg/L 时各指标达到最大值。在其他培养条件相同的情况下，随着6-BA 浓度从0.5 mg/L 增加到2.0 mg/L，原球茎的增殖数亦逐渐增加，当6-BA 浓度为2.0 mg/L 时增殖数最多且增殖所得苗更健壮[19]。此外，外源施用茉莉酸可促进白及幼苗生长，但施用水杨酸则会抑制白及幼苗生长，而同时施用适当浓度的茉莉酸、水杨酸和内生真菌不但可以提高白及幼苗的抗逆性，还能在一定程度上提高幼苗总酚含量[20]。

保证增殖率的同时，提高增殖所得球茎质量可为幼苗健康成长奠定良好基础，增殖后形成的球茎重量越重、直径越大，则球茎贮藏的养分越多，移栽后种苗成活率越高[18]。如在1/2MS 培养基中添加20.0 g/L蔗糖，得到的球茎直径较其他蔗糖浓度处理更大[18]。朱秀蕾[11]用LED 光源在原球茎增殖分化阶段进行处理，发现红蓝光比为2 ∶1 时，不但可提高增殖系数，还能促进白及组培苗生根及多糖积累，有利于提高白及品质；且相较于单一光源处理，白及幼苗在红蓝光组合处理或白光处理下更为健壮。

1.3 壮苗生根

白及苗生根情况好坏直接影响着移栽成活率的高低。使用MS 培养液（无肌醇，无水氯化钙和硝酸钾含量均减半）+ 80 g/L 香蕉泥+20 g/L 蔗糖+4 g/L 艾蒿叶干粉+0.5 mg/L NAA 的培养基[12]，或者MS+2.0 g/L 活性炭+0.5 mg/L IBA+0.1 mg/L IAA 的培养基[14]，均可使生根率达到100%。另外，在生根培养基中搭配使用NAA 和6-BA 也能得到较好的生根效果[4]。林伊利等[21]进一步研究了不同配比的NAA 和6-BA 对白及苗生根的影响，发现NAA 对不定根的分化影响显著大于6-BA。王跃华等[14]研究了不同浓度IBA 与IAA 配比对白及苗生根的影响，认为IBA 才是影响生根的主要因素。NAA 和IBA 中谁更利于白及不定根的诱导，或者二者组合使用诱导效果如何，目前尚未见报道，有待进一步研究。此外，培养基中添加蔗糖[18]或香蕉汁[21]均可较好地促进白及苗生根。

1.4 炼苗移栽

炼苗是组培苗适应外界环境的一个重要环节，一般在春夏两季进行，春季最为适宜[22]。以基本产生了假鳞茎且带3～5 条或以上粗壮根系的组培苗为炼苗对象[23-24]，炼苗温度范围以15～28℃为宜[23]，空气相对湿度范围在80%～90%[5]，开瓶锻炼适应时间不宜超过6 d[25]，若是闭瓶露苗则最佳时间为30 d[26]。白及组培苗移栽前应将根系上的培养基清洗干净，以防细菌感染导致根系腐烂，移栽后则要适度遮阴并保持一定的土壤湿度[21,24]。相较于直接将组培苗移栽至基质中，移栽前先用30%生根剂将组培苗根浸泡15 min，可将新根长出时间缩短为1～4 d，侧芽萌发率可提高45%左右[14]；也可以先用0.1%多菌灵溶液浸泡整株，然后用1.5 mg/L IBA 浸泡3 h 来提高移栽苗成活率[27]。

移栽基质是植株养分、水分的供应载体，其通气性、含水量、酸碱度、养分含量等均会对组培苗根系微环境产生影响，因此移栽基质的选择对组培苗移栽成活率至关重要。白及性喜肥，其根系为气生肉质根系，故宜选肥效高、保水透气性好、微酸性的移栽基质[26]。为消除单一基质带来的不良影响，移栽基质一般由多种基质合理搭配混合而成，如樊金山等[28]发现用草炭、杏鲍菇菌渣、珍珠岩、稻壳按体积比3∶1∶1∶1的比例混合，或者用草炭、珍珠岩、稻壳按体积比4∶1∶1的比例混合而成的基质，其理化性质均在适合白及生长的范围内，且2 a 后植株成活率达90%以上，植株多糖含量大于70%，块茎重量大于500 g。还有研究表明，有机质比无机质更适合做白及组培苗栽培基 质[29]。例如椰糠[30]、刨花[31]、腐殖质[26]、杏鲍菇菌渣[28]、玉米芯[29]等有机质，既富含多种营养，又具有良好的透气保水性，非常有利于白及苗根系生长，同时还可为植株生长提供充足养分。

2 总结与展望

综上所述，白及组培苗繁育前2 个阶段较为复杂和关键，通常认为这2 个阶段中植物激素起关键作用[16]，然而不同阶段激素浓度和配比不同，增殖效果亦存在一定差异。在种子萌发及原球茎诱导阶段，以近成熟的白及种子作为外植体材料、采用红蓝光比为 1 ∶1 的LED 光源、在培养基中添加适量的6-BA 等技术手段均可有效缩短培养周期，提高种子萌发率，技术优势较为突出；在原球茎增殖分化阶段，于培养基中添加马铃薯添加物可提高增殖系数，并且该阶段NAA 比6-BA 的作用效果更好，选用红蓝光比为2 ∶1的LED 灯为光源，既可保证较高的增殖系数，还能促进组培苗生根和白及多糖积累，有利于白及品质提升；在壮苗生根阶段，NAA 和IBA 均能很好地促进不定根的生成；在炼苗移栽阶段，确定适宜的温湿度后，可因地制宜选择保水透气性好、肥效高的微酸性移栽基质，其中以多种混合型有机质为移栽基质效果更好。然而，针对前2 个阶段的多种优势技术的研究多为单独运用，尚无研究将其进行有机融合，同时运用其中的某几种或全部技术是否比单独运用其中一种技术更具优势有待进一步研究。目前，白及价格下滑幅度较大[2]，降低组培苗价格可保证白及种植户获得更高的经济效益，促进白及产业可持续发展，因此最大限度的缩短育苗周期、简化育苗方式、降低育苗成本将是白及组培苗繁育技术未来的研究方向。