白蛋白对肾小管上皮细胞转分化的影响及其分子机制

白瑜，于锐，田密，何平，赵自霞，张蓓茹 中国医科大学附属盛京医院，沈阳110004

肾小管损伤是慢性肾脏病(CKD)发生发展的一个重要机制，与患者的肾脏预后密切相关[1]，而蛋白尿导致的肾小管上皮细胞转分化是肾小管损伤的重要病理机制之一。近年研究表明，肾损伤分子1(KIM-1)不仅可以作为急慢性肾损伤的早期生物学标志物，还参与了肾脏损伤与修复过程[2]。前期研究显示，原发性肾小球肾炎患者肾小管间质损伤程度及蛋白尿严重程度与尿KIM-1水平呈正相关关系[3]，但KIM-1在白蛋白所致肾小管间质损伤中的病理机制尚不明确。2015年1月～2017年1月，本研究观察了白蛋白对肾小管上皮细胞转分化的影响，并探讨其机制是否与KIM-1有关及其可能的调控途径。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 细胞：人肾小管上皮细胞系HK-2购于广州吉尼欧生物科技有限公司。主要试剂：DMEM/F12培养液、胎牛血清、Opti-MEM均购于美国Hyclone公司，LipofectamineTM2000购于美国Invitrogen公司，青-链霉素溶液、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、细胞膜蛋白与胞浆蛋白提取试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)均购于北京碧云天生物科技有限公司；人血清白蛋白(HSA)和HRP标记的山羊抗兔IgG抗体均购于美国Sigma公司，KIM-1和α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)抗体均购于美国Abcam公司，p38、p-p38和E钙黏素(E-cadherin)抗体均购于美国CST公司，p38分裂原激活蛋白激酶(p38 MAPK)通路特异性抑制剂SB203580购于美国Selleck Chemicals公司。

1.2 HSA对HK-2细胞转分化及KIM-1表达影响的观察

1.2.1 细胞培养及HSA处理 将HK-2细胞置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中，用含10%胎牛血清、100 U/mL青-链霉素的DMEM/F12培养基进行培养。当细胞生长至70%融合时进行细胞传代，取3～5代对数生长期的HK-2细胞，加入5 mg/mL HSA作用24 h。

1.2.2 HSA作用前后细胞E-cadherin、α-SMA、KIM-1、p-p38、p38表达检测 采用Western blotting法。收集1.2.1经HSA作用前后的HK-2细胞，按照提取试剂盒说明书提取蛋白，BCA蛋白定量试剂盒法测定蛋白浓度。加入蛋白上样缓冲液并煮沸，取等量蛋白进行SDS-PAGE电泳，半干法转膜及5% BSA封闭1 h。按照抗体说明书推荐比例对E-cadherin、α-SMA、KIM-1、p-p38和p38一抗进行稀释，4 ℃条件下孵育过夜；加入HRP标记的二抗,室温孵育1 h，TBST洗膜3次；加入ECL发光液显影，采用Image J图像分析系统进行灰度值分析。GAPDH为内参，以目的蛋白与内参蛋白灰度值的比值计算E-cadherin、α-SMA、KIM-1、p-p38、p38蛋白相对表达量。

1.3 KIM-1沉默对HSA作用后HK-2细胞转分化影响的观察

1.3.1 质粒转染及细胞分组处理 取3～5代对数生长期的HK-2细胞，以5×105/孔接种于6孔板，细胞生长至70%～80%融合时，更换无血清培养液进行培养。将细胞随机分为KIM-1沉默组和空载体对照组，参照LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书分别转染KIM-1 siRNA及对照空载体；转染48 h后加入5 mg/mL HSA处理24 h。

1.3.2 细胞E-cadherin、α-SMA、KIM-1表达检测 参照1.2.2，采用Western blotting法检测两组细胞E-cadherin、α-SMA、KIM-1蛋白相对表达量。

1.4 KIM-1过表达对HSA作用后HK-2细胞转分化及p38 MAPK通路影响的观察

1.4.1 KIM-1过表达质粒转染及细胞分组处理 取3～5代对数生长期的HK-2细胞，以5×105/孔接种于6孔板，细胞生长至70%～80%融合时，更换无血清培养液进行培养。将细胞随机分为SB203580+KIM-1组、KIM-1组和HSA组，SB203580+KIM-1组、KIM-1组均参照LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书转染KIM-1过表达质粒48 h，SB203580+KIM-1组给予10 μmol/L SB203580预处理1 h后再与5 mg/mL HSA共处理24 h，KIM-1组、HSA组给予5 mg/mL HSA处理24 h。

1.4.2 细胞E-cadherin、α-SMA、KIM-1、p-p38、p38表达检测 参照1.2.2，采用Western blotting法检测三组细胞KIM-1、E-cadherin、α-SMA、p-p38、p38蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 HSA作用前后HK-2细胞E-cadherin、α-SMA、KIM-1、p-p38、p38表达比较 与HSA作用前比较，HSA作用后HK-2细胞E-cadherin表达降低，α-SMA、KIM-1、p-p38表达均升高(P均<0.05)，p38表达变化无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 HSA作用前后HK-2细胞E-cadherin、α-SMA、KIM-1、p-p38、p38表达比较

2.2 KIM-1沉默组和空载体对照组E-cadherin、α-SMA、KIM-1表达比较 与空载体对照组比较，KIM-1沉默组E-cadherin表达升高，α-SMA、KIM-1表达均降低(P均<0.05)。见表2。

表2 KIM-1沉默组和空载体对照组E-cadherin、α-SMA、KIM-1蛋白表达比较

2.3 SB203580+KIM-1组、KIM-1组和HSA组E-cadherin、α-SMA、KIM-1、p-p38、p38表达比较 KIM-1组、SB203580+KIM-1组和HSA组E-cadherin表达依次升高，α-SMA、p-p38表达均依次降低(P均<0.05)，三组p38表达比较均无统计学差异(P均>0.05)。SB203580+KIM-1组、KIM-1组KIM-1表达均高于HSA组，SB203580+KIM-1组、KIM-1组KIM-1表达比较无统计学差异(P>0.05)。见表3、图1。

表3 SB203580+KIM-1组、KIM-1组和HSA组E-cadherin、α-SMA、KIM-1、p-p38、p38蛋白表达比较

图1 SB203580+KIM-1组、KIM-1组和HSA组KIM-1、E-cadherin、α-SMA、p-p38、p38蛋白表达条带图(Western blotting法)

3 讨论

白蛋白尿导致的肾小管上皮细胞转分化是造成肾小管损伤、促进CKD进展的重要因素[4]，探究其病理机制及干预策略也是CKD治疗领域备受关注的方向。KIM-1是在肾小管上皮细胞表达的一种跨膜蛋白，在正常肾脏组织中几乎不表达，但是在各种急性肾损伤时肾组织KIM-1表达明显升高。目前，KIM-1已经成为判断急性肾损伤的一种特异性生物标志物[5]，能够有效预测急性肾损伤的病情和预后，且与急性肾损伤进展至CKD具有一定的相关性[6,7]。除了与急性肾损伤相关，KIM-1与CKD也具有一定的相关性，是CKD进展至终末期肾脏病的独立危险因素[8,9]。本研究结果显示，HSA可导致HK-2细胞发生转分化及KIM-1蛋白表达增加。这一结果也再次证明KIM-1的升高能够参与肾小管损伤。

KIM-1不仅仅是急性肾损伤或CKD的生物标志物之一，其在肾脏病进展中也具有重要的病理作用。Humphreys等[10]建立了肾小管上皮细胞持续表达KIM-1的转基因小鼠，发现即使在没有外界任何促进肾小管间质损伤的因素存在下，4周后转基因小鼠也会自发出现肾脏炎症反应和肾小管间质纤维化，且进行性加重；该实验提示KIM-1在CKD肾小管损伤中具有重要的病理作用，可能与促进局部炎症反应或肾小管损伤等因素有关。而在蛋白超负荷肾病大鼠模型以及在阿霉素所致伴有大量蛋白尿的肾病模型中，均可发现尿中KIM-1排泄增多，与尿蛋白和肾间质损伤呈正相关关系，且KIM-1仅在炎症、纤维化及肾小管损伤区域表达[11,12]。因此，本研究进一步探讨KIM-1是否参与了白蛋白所致的肾小管上皮细胞转分化过程。本研究结果显示，当KIM-1沉默时伴随着KIM-1水平降低、白蛋白所致肾小管上皮细胞转分化程度减轻，这一结果提示在白蛋白所致肾小管上皮细胞转分化过程中KIM-1不仅仅是肾小管损伤的标志物，而且在这个损伤过程中发挥了重要的病理作用。

目前，KIM-1参与肾脏损伤的病理机制尚不明确。MAPK是真核生物细胞主要信号转导通路，而p38 MAPK是其中功能最为广泛的分支之一，在人体组织中广泛存在，参与调控细胞凋亡、氧化应激及炎症反应等。有研究证实，p38 MAPK通路活化能够加速肾小管上皮细胞转分化[13]。Tian等[14]研究发现，CKD组织尤其是肾小管间质纤维化组织KIM-1表达明显增加，而且KIM-1会通过MAPK通路而促进肾脏局部巨噬细胞迁移及炎症进展。因此，本研究进一步探讨了在KIM-1促进白蛋白所致肾小管上皮细胞转分化过程中是否有p38 MAPK的参与。结果显示，HSA作用HK-2细胞发生转分化的过程中p38 MAPK磷酸化增强，而KIM-1沉默可减轻p38 MAPK的磷酸化程度、KIM-1过表达可促进p38 MAPK的磷酸化程度；p38 MAPK特异性抑制剂预处理HK-2细胞可有效抑制p38 MAPK磷酸化、减轻HK-2细胞的转分化程度，但并不影响KIM-1表达；这表明p38 MAPK作为下游通路，至少部分介导了KIM-1促进白蛋白导致肾小管上皮细胞转分化的病理过程。

综上所述，白蛋白可促进肾小管上皮细胞转分化，其机制可能与促进KIM-1表达进而激活p38 MAPK通路有关。本研究也再次证明KIM-1并不仅仅是急性或慢性肾损伤的生物标志物，而是具有重要的病理作用，对KIM-1病理机制的探索可能为将来有效防治CKD提供有效手段。