一氧化氮在大鼠短暂性局灶性脑缺血损伤中对神经生长因子和脑源性神经营养因子表达的影响

杨 楠 丁 锚 黄语悠 房亚兰 师文娟 赵咏梅

(首都医科大学宣武医院中心实验室 北京市老年病医疗研究中心，北京 100053)

神经生长因子(nerve growth factor,NGF)和脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)属于神经营养素家族成员。NGF是神经系统中重要的生物活性分子之一，对神经细胞的存活和生长起重要作用。BDNF是一种广泛分布于中枢神经系统的神经营养因子[4]，与神经元损伤后再生修复有关。研究[5]显示，永久性脑缺血后，NGF和BDNF表达上调，但再灌注后NGF和BDNF如何变化却鲜有报道。缺血半暗带区是指存在于脑梗死中心部位周围的缺血但没有坏死的、处于可逆状态的脑组织区域，由于血管再通和挽救更多的缺血半暗带是脑保护药物研发的一个重要靶点，所以探究再灌注后缺血半暗带区NGF和BDNF的表达变化十分重要。研究[6-7]显示，NGF诱导PC12细胞神经突起的生长需要NO的存在，NO可通过cGMP通路诱导背根神经节细胞产生NGF。内源性NO能调控BDNF的产生，同时BDNF也能诱导皮质神经元中NO的产生[8]，说明NO和BDNF可以相互调节。研究[6-8]显示，NO参与NGF和BDNF等神经营养素家族成员的调控。本研究采用大鼠大脑中动脉梗死(middle cerebral artery occlusion,MCAO)再灌注模型即短暂性局灶性脑缺血模型，观察脑缺血再灌注大鼠在不同时间点NGF和BDNF表达的变化，以及应用NO合酶(nitric oxide synthase,NOS)抑制剂N-硝基-L-精氨酸甲酯(Nω-nitro-L-arginine methyl ester,L-NAME)，对脑缺血大鼠再灌注后NGF、BDNF表达的影响，从而研究在脑缺血再灌注损伤过程中NGF和BDNF表达随再灌注时间变化的趋势以及NO对其表达的调控，探讨脑缺血损伤的深层机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组及处理

健康雄性SD大鼠，体质量280～320 g，北京维通利华实验动物公司，实验动物许可证号：SCXK(京)2012-0001。42只SD大鼠采用数字表法随机分为7组：假手术(Sham)组；MCAO再灌注0 h(MCAO 0 h)组；MCAO再灌注6 h(MCAO 6 h)组；MCAO再灌注12 h(MCAO 12 h)组；MCAO再灌注24 h(MCAO 24 h)组；MCAO再灌注72 h(MCAO 72 h)组；以及MCAO 24 h+L-NAME组。每组6只大鼠。MCAO术前30 min腹腔注射L-NAME[溶于0.9%(质量分数)氯化钠注射液，1 mg/kg]，Sham组和MCAO组大鼠腹腔注射同等体积0.9%(质量分数)氯化钠注射液。

1.2 仪器及试剂

小动物呼吸机和麻醉机(美国Harvard Apparatus公司)、手术显微镜(德国Carl Zeiss公司)、反馈式温度调节仪(CMA 150,瑞典Carnegie Medicin公司)、双极电凝器(DEVEL，ACC100)、冰冻切片机(美国Thermo Fisher Scientific公司)、荧光显微镜(日本Nikon公司)。恩氟烷和水合氯醛购自河北一品制药公司，L-NAME购自美国Sigma公司，3-NT、NGF、BDNF抗体均购自英国Abcam公司。

1.3 动物模型制作

MCAO大鼠模型的制备依照改良Zea Longa法。先在70%(体积分数)N2O和30%(体积分数)O2中混合5%(体积分数)恩氟烷诱导麻醉，后改用2%(体积分数)恩氟烷维持麻醉。沿大鼠经颈部作正中切口，切开皮肤和皮下组织，分离右侧颈总动脉并夹闭，颈外动脉凝断后，将尼龙线栓自颈外动脉残端插进颈内动脉，至线栓顶端到达距颈总动脉分叉约1.8～2.0 cm 有阻力感处停止。缺血90 min后，拔出线栓进行再灌注。逐层缝合肌肉、皮肤，再次消毒。术中监测大鼠各项生理参数在正常范围[9]。

1.4 免疫荧光染色

MCAO组大鼠于再灌注0、6、12、24及72 h，用水合氯醛麻醉，处死取脑，用OCT包埋后，行厚度为20 μm 的连续冰冻切片。用预冷的4%(质量分数)多聚甲醛固定10 min后，用0.2%(体积分数)Triton X-100进行破膜10 min，滴加5%(体积分数)正常山羊血清室温封闭30 min，弃血清，滴加一抗(NGF抗体做1∶200稀释，BDNF抗体做1∶200稀释)，4 ℃孵育过夜。阴性对照不加一抗，用PBS替代。次日将切片用PBS洗后，滴加荧光二抗(1∶300稀释)，室温避光孵育1 h。PBS漂洗后，用含DAPI的封片剂封片。

1.5 免疫荧光双标染色

取Sham组、MCAO 24 h组以及MCAO 24 h+L-NAME组大鼠脑组织冰冻切片，于预冷的4%(质量分数)多聚甲醛中固定10 min后，用0.2%(体积分数)TritonX-100破膜10 min，之后滴加5%(体积分数)山羊血清室温封闭30 min，弃血清，滴加3-NT与NGF抗体(3-NT抗体做1∶300稀释，NGF抗体做1∶200稀释)，或3-NT与BDNF抗体(3-NT抗体做1∶300稀释，BDNF抗体做1∶200稀释)，4 ℃孵育过夜。阴性对照不加一抗，用PBS替代。次日将切片用PBS洗后，滴加荧光二抗(1∶300稀释)，室温避光孵育1 h。PBS漂洗后，用含DAPI的封片剂封片。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 脑缺血大鼠再灌注后各时间点缺血半暗带区NGF和BDNF表达的变化

脑缺血大鼠再灌注后各时间点缺血半暗带区NGF和BDNF表达，差异有统计学意义(F(2，12)=1119.93，P<0.05)。MCAO再灌注0、6 h组大鼠脑组织几乎见不到NGF和BDNF阳性细胞。MCAO再灌注12 h组大鼠，脑缺血半暗带区域可见NGF和BDNF阳性细胞，数量与0、6 h组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。再灌注24 h时，MCAO组大鼠脑缺血半暗带区NGF和BDNF阳性染色细胞数量较再灌注12 h组进一步增加(P<0.05)；至再灌注72 h，半暗带区NGF和BDNF阳性染细胞数较再灌注24 h组减少(P<0.05)。脑缺血再灌注可引起NGF和BDNF表达水平上调，再灌注72 h内呈现先升高，再降低的趋势(图1A～C)。

图1 免疫荧光染色法检测再灌注后各时间点大鼠脑缺血半暗带区NGF和BDNF的表达Fig.1 Dynamic changes of NGF and BDNF during reperfusion time in cerebral ischemia penumbra of MCAO rats by immunofluorescence stainingA：representative images of NGF-fluorescence staining (red) in MCAO group rats at 0,6,12,24 and 72 h after reperfusion;B:representative images of BDNF-fluorescence staining (green) in MCAO group rats at 0,6,12,24 and 72 h after reperfusion.Bars=20 μm;C：comparison of NGF and BDNF positive cell numbers in MCAO group rats.n=5.*P<0.05 vs 0 h and 6 h group,#P<0.05 vs 12 h group，△P<0.05 vs 24 h group；NGF:nerve growth factor;BDNF:brain derived neurotrophic factor;MCAO:middle cerebral artery occlusion;DAPI:4′,6-diamidino-2-phenylindole.

2.2 脑缺血大鼠半暗带区NGF和BDNF分别与3-NT共定位

MCAO再灌注24 h组大鼠缺血侧半暗带区内，NGF和BDNF阳性细胞呈绿色，3-NT阳性细胞呈红色，胞核呈蓝色。合并图像发现，绿色荧光与红色荧光重合，表明NGF和BDNF分别与3-NT共定位，提示在缺血再灌注后，NGF和BDNF表达量的上调与NO的过量产生相关(图2A,B)。

图2 免疫荧光双标染色法检测Sham、MCAO 24 h与MCAO 24 h+L-NAME组大鼠脑缺血半暗带区3-NT与NGF、3-NT与BDNF的表达Fig.2 Expression of 3-NT (red) and NGF (green),3-NT (red) and BDNF (green) in cerebral ischemia penumbra of rats of Sham,MCAO 24 h and MCAO 24 h+L-NAME groups by immunofluorescence double stainingA:representative double immunofluorescence staining showing the colocalization of 3-NT (red) and NGF (green) in the ischemic penumbra of MCAO rats.B:representative double immunofluorescence staining showing the colocalization of 3-NT (red) and BDNF (green) in the ischemic penumbra of MCAO rats.Bars=20 μm;C:quantification of 3-NT and NGF double staining positive cell.n=5.D:quantification of 3-NT and BDNF double staining positive cell.n=5.*P<0.05 vs Sham group,#P<0.05 vs MCAO group;MCAO:middle cerebral artery occlusion;DAPI:4′,6-diamidino-2-phenylindole;L-NAME:Nω-nitro-L-argininic methyl ester;3-NT:3-nitrotyrosine;NGF:nerve growth factor;BDNF:brain derived neurotrophic factor.

2.3 L-NAME抑制脑缺血大鼠半暗带区NGF的表达

Sham组因没有缺血半暗带区，其对应脑区内未见3-NT和NGF双标阳性细胞，MCAO 24 h组大鼠缺血半暗带区可见大量的3-NT和NGF双标阳性细胞；MCAO 24 h+L-NAME组大鼠该区域3-NT和NGF双标阳性细胞数量比MCAO 24 h组明显减少(图2)，组间比较差异有统计学意义(F(2，12)=339.644，P<0.05)。

2.4 L-NAME抑制脑缺血大鼠半暗带区BDNF的表达

Sham组大鼠未见3-NT和BDNF双标阳性细胞，MCAO 24 h组大鼠缺血半暗带区可见大量的3-NT和BDNF双标阳性细胞；而MCAO 24 h+L-NAME组大鼠该区域3-NT和BDNF双标阳性细胞数量比MCAO 24 h组明显减少(图2)，组间比较差异有统计学意义(F(2，12)= 442.905，P<0.05)。

3 讨论

神经营养因子是调节神经系统发育、成熟和维持神经功能的蛋白质。研究[10]显示，生理状态下NGF在脑内含量极低。刘鹏等[5]发现，永久性脑缺血模型48 h，大鼠脑内NGF和BDNF 阳性细胞数比假手术组大鼠增加，表明脑缺血本身就能上调NGF和BDNF的表达，但脑缺血再灌注后NGF和BDNF表达如何变化，特别是两者随再灌注时程的变化趋势却鲜有报道。再灌注引起的血流再通既可使半暗带脑组织逐渐恢复正常，亦可使脑损伤继续加剧，造成再灌注损伤，因此，研究具有脑保护作用的NGF和BDNF在再灌注后的表达变化很有意义。本研究中，脑缺血再灌注可引起大鼠脑组织NGF和BDNF表达上升，且在24 h内随着再灌注时间延长，NGF和BDNF的表达水平递增，至24 h达到顶峰。由于NGF和BDNF可保护损伤神经元，增强抗凋亡因子表达进而促进细胞存活。因此，大鼠再灌注后24 h内NGF和BDNF表达逐步升高很可能是缺血性脑损伤的一种内源性保护机制，缺血大鼠可能通过NGF和BDNF的代偿性增高，来保护大鼠脑缺血半暗带区内处于休眠状态或半休眠状态的神经细胞，使其向正常细胞转化并恢复神经功能。本研究中，与再灌注24 h组大鼠相比，再灌注72 h组大鼠脑组织NGF和BDNF的表达水平有所下降。研究[11]显示，神经元是脑缺血损伤后产生BDNF的唯一来源，因此，很可能是由于再灌注72 h时脑组织损伤比再灌注24 h进一步加重，神经元死亡数量也进一步增多，从而导致此时NGF和BDNF的表达水平比再灌注24 h下降。

脑缺血后的神经损伤机制十分复杂，氧化应激是引起脑缺血再灌注损伤的主要因素之一[12]，其中NO在氧化应激损伤中的作用尤为重要。脑缺血再灌注后，NOS表达上调，NO大量产生[13]。本课题组[9]前期研究结果表明，NO的含量在再灌注时升高，至再灌注24 h达到顶峰。抑制NOS活性可以减少脑组织中NO的产生，对大鼠脑缺血再灌注损伤产生保护作用[14]。本研究结果显示，缺血再灌注24 h大鼠脑内NGF和BDNF表达上调且均与3-NT共定位，提示脑缺血再灌注大鼠脑内NO的过量产生与NGF和BDNF的上调存在关联。研究[15]显示，轴突受到损伤后，神经节中NO活性增加，激活神经胶质细胞使其合成NGF增多，而且内源性NO能调控BDNF的产生[8]。因此，可以推测，在缺血再灌注24 h，过量产生的NO促进了脑缺血再灌注损伤，导致NGF和BDNF的表达上调。此时NGF和BDNF表达上调是一种应激性上调，是脑内应对损伤的一种内源性保护。

本研究结果还显示，MCAO 24 h+L-NAME组大鼠脑内的3-NT和NGF双标阳性细胞、以及3-NT和BDNF双标阳性细胞数目均比MCAO 24 h组降低，这很可能是由于L-NAME抑制大鼠脑缺血再灌注后NO的产生，降低了脑缺血大鼠的脑损伤程度，从而使得NGF和BDNF的应激性上调有所恢复。该结果进一步验证，过量的NO引起的脑缺血再灌注损伤导致了NGF和BDNF表达的应激性上调。

总之，本研究通过研究脑缺血大鼠再灌注72 h内NGF和BDNF表达水平的时程变化，证明在脑缺血再灌注后24 h内NGF和BDNF表达水平持续增加，与脑缺血损伤的内源性保护有关。而再灌注72 h，由于神经元的大量死亡，脑损伤进一步加重，NGF和BDNF表达水平比再灌注24 h下降。本研究还探究了在再灌注损伤过程中，NO与NGF和BDNF之间的关系，证明在脑缺血再灌注24 h内，大量产生的NO引起NGF和BDNF的应激性上调，参与脑缺血损伤的内源性保护。使用NOS抑制剂L-NAME清除NO产生了脑保护作用，NGF和BDNF应激性上调恢复。本研究为进一步探讨氧化应激和神经营养因子在脑缺血再灌注损伤中的相互作用提供了科学依据。