‘兴义矮脚鸡’与‘贵州矮脚黄鸡’杂交试验

叶涛,吴古荣，李辉,王姣，罗韦，杨金春

(1.贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室，贵州 贵阳 550025；3.贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳550025；4.贵州省兴义市农业农村局，贵州 兴义 562400)

我国地方品种鸡分布区域广泛,同一省份地方鸡种繁多[1].贵州‘兴义矮脚鸡’因其产于贵州省黔西南州兴义市及周边地区，体型矮小，胫长短小而得名[2].‘兴义矮脚鸡’属于兼用型品种，体躯匀称，体质结实，胫短，体呈匍匐状，羽色分黄羽、麻羽、黑羽3种，单冠，肉嫩味鲜，适应性强.1993年被收录于《贵州省畜禽品种志》，2006年被列入《国家畜禽遗传资源保护名录》，2011年被收录于《中国畜禽遗传资源志》[3].

家禽的Cp(creeper)基因是由Landauer 和Dunn[4]命名的，他们通过杂交试验，发现了一种软骨发育不正常的矮小的匍匐型鸡，这种鸡的匍匐性状是由常染色体上显性纯合致死基因Cp控制，这是一个引起软骨不正常发育的半致死基因，显性纯合子(Cp/Cp)表现为致死型，在孵化的过程中将全部死亡，杂合子(Cp/+)表现为匍匐型，隐性纯合子(+/+)表现为野生型.曹娟等[5]的研究证实了‘兴义矮脚鸡’的矮脚性状就是Cp基因导致的.金四华[6]进一步的研究表明Cp基因决定‘兴义矮脚鸡’矮脚性状的遗传机理是由7号染色体上印度刺猬因子[7](Indianhedgehog，IHH)基因的缺失所引起.IHH主要与骨骼的发育有关，参与调节软骨的分化[8].

1935年苏联学者Behtank就发现了dw基因.对dw基因进行进一步的研究之后发现，dw和DW是不完全隐性等位基因[9].dw基因位于鸡Z染色体，属于伴性遗传，正常基因DW对dw显性，只有dw纯合子的公鸡和携带dw基因的母鸡才表现矮小性状[10].dw基因并不是直接影响鸡的生长生理，而是通过调控其他的基因的表达，从而影响鸡体内有关激素分泌和相关酶的形成，鸡的生长性能就会受到很大的影响.Leung等[11]的研究推测出GHR基因缺失或GHR数量减少是使鸡产生矮小性状的主要原因.Burnside[12]等进行进一步的研究发现，GHR基因上的一个突变可能是矮小鸡特殊表型的原因.dw基因是影响矮脚性状的基因中唯一对鸡本身健康无害的隐性、伴性突变基因[13].在鸡的饲养中，dw基因会使饲料消耗量减少20%左右，提高蛋鸡的产蛋性能，降低畸形蛋和软壳蛋的发生率，减少破蛋率[14].如贵州大学选育的dw基因控制的‘矮脚黄鸡’，由于胫短而导致身矮，性情温驯而且耗料少,，是笼养或规模化养殖的特选鸡种[15].

正因为Cp基因纯合子在孵化期全部致死，因此后代所观察到的矮脚鸡只能是杂合子，不能稳定遗传，后代出现矮脚、高脚的分离现象，直接影响到经济效益，所以在‘兴义矮脚鸡’产业的发展中需要通过品种改良来解决这一问题.本研究引入‘贵州矮脚黄鸡’对‘兴义矮脚鸡’进行杂交，采用标记辅助选育，经过2代杂交用dw基因代替兴义矮脚鸡的Cp基因，以期保留矮脚性状的同时解决矮脚性状不能稳定遗传的生产问题,这是一次新的育种尝试.本研究检测了‘兴义矮脚鸡’和杂交F1代的Cp基因和dw基因，测定并分析了杂交F1代及其亲本的不同日龄的胫长，为F1代自交提供选种依据.

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物 该试验以‘兴义矮脚鸡’‘贵州矮脚黄鸡’‘兴义矮脚鸡’杂交F1代鸡作为研究对象，其中‘贵州矮脚黄鸡’由贵州大学种鸡场选育提供，‘兴义矮脚鸡’由兴义鸿鑫农业发展有限责任公司种鸡场选育提供.试验动物的孵化、饲养、胫长实验数据测量和样品采集在兴义鸿鑫农业发展有限责任公司种鸡场进行，试验动物的饲养条件保持一致.

随机对30只‘兴义矮脚鸡’和107只‘兴义矮脚鸡’杂交F1代分别进行血样采集，肝素钠抗凝管放置于冰盒暂时保存，运回实验室以后改用冰箱-20 ℃保存.

1.2 试验方法

1.2.1 胫长测定 分别测定‘兴义矮脚鸡’‘矮脚黄鸡’和兴黄杂一代鸡各鸡群0、2、4、6、8、10、12、14、18、20周龄胫长.

1.2.2 鸡血液基因组DNA的提取 本试验使用血液基因组DNA提取试剂盒(北京天根)，对鸡血液样品进行基因组DNA的提取，使用微量紫外分光光度计检测浓度和纯度，-20 ℃保存备用.

1.2.3 引物设计与合成dw基因的扩增使用的2对引物参照冒世杰等[16]的研究，序列分别为F1F:5′-TCCCAGACTACACTTCTATTCA-3′;F1R:5′-CGGGGACAGATCAAAGACAATAC-3′;F2F:5′-ACCTCCAAAGAAATCTGTCGAG-3′;F2R:5′-TGGCCAAATCCTGAAGTCCT-3′，Cp基因PCR引物序列参照金四华[6]的研究，序列见下表，以上引物均由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成.

表1 PCR引物序列

1.2.4 PCR扩增dw基因的PCR扩增反应体系采用20 μL体系，1 μL DNA,引物F1F、F1R、F2F、F2R分别为1 μL,PCR Master MIX(2×)为10 μL,5 μL dd H2O.聚合酶链式反应条件为:95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，62.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，32个循环，72 ℃终止延伸10 min，4 ℃保存.

Cp基因进行PCR扩增所采用的体系为15 μL，其中DNA1 μL，两对引物各2 μL，,PCR Master MIX(2×)为6 μL，用ddH2O补足15 μL.聚合酶链式反应条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环，72 ℃终止延伸5 min，4 ℃保存.

扩增反应结束后将产物放入-20 ℃冰箱中保存备用，或直接用于1%TBE凝胶电泳实验来鉴定基因型.

1.3 数据处理

本研究采用SPSS 18.0软件，区分公母鸡，对‘兴义矮脚鸡’‘贵州矮脚黄鸡’和杂交F1鸡群不同周龄的胫长数据进行单因素方差分析，采用Duncan法进行多重比较.

2 结果与分析

2.1 dw基因的鉴定

将扩增所得的产物进行琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成相系统观察DNA条带.结果显示：显性纯合型鸡的基因型为ZDWZDW或者ZDWW,只扩增出1条417 bp的条带，杂合型的检测鸡的基因型为ZDWZdw,扩增出1条217 bp的条带和一条417 bp的条带，隐性纯合型检测鸡的基因型为ZdwZdw或者ZdwW,只扩增出1条217 bp的条带(图1).根据性别结合琼脂糖凝胶电泳结果，判断107只杂交鸡个体的基因型，计算群体的基因型频率，结果见表2.

图1 基因型的鉴定结果Figure 1 Identification results of genotypes

2.2 Cp基因的鉴定

‘兴义矮脚鸡’杂交F1代的Cp基因PCR扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳(图2).

图2 杂交F1代PCR扩增结果Figure 2 PCR amplification results of F1generation hybrid

表2 杂交F1代鸡dw基因遗传特性

由上图结果显示：杂交F1代PCR扩增产物在1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测中也只产生2种类型的条带，其中只有438 bp的条带个体的基因型为(+/+)高脚型，同时得出438 bp和224 bp 2条条带的基因型为(Cp/+)杂合子型.

通过凝胶电泳成像，分析2种鸡所含的基因，判断在杂交F1代中是否将致死基因Cp剔除，并计算出各种鸡所含基因型的基因型频率，其结果统计如表3所示，结合以上dw基因与Cp基因的鉴定结果，发现在107只杂交F1代鸡中，既含有dw基因又不含Cp基因的个体数为19只.

2.3 胫长结果与分析

应用SPSS 18.0软件根据不同类型鸡在不同周龄测得的胫长数据，区分公母进行单因素方差分析，Duncan法多重比较，结果如表4所示.杂交F1代鸡初生时的胫长与‘兴义矮脚鸡’对比差异显著，同‘贵州‘矮脚黄鸡’’对比差异极显著，在6周龄以前，‘贵州‘矮脚黄鸡’’胫长都长于‘兴义矮脚鸡’，杂交F1代鸡的胫长位于两者之间.各品种中公鸡的胫长在0～20周龄都大于母鸡的胫长.公鸡的胫长除了在10周龄时，杂交F1代鸡与其它两者差异极显著，在其它周龄差异都不显著，0～20周龄，杂交F1代母鸡与‘兴义矮脚鸡’母鸡差异都不显著.12周龄以后，杂交F1代公鸡和‘兴义矮脚鸡’公鸡之间，以及杂交F1代母鸡和‘兴义矮脚鸡’母鸡之间的胫长对比都差异不显著.

表3 两种鸡的三种基因型频率统计结果

表4 不同周龄鸡胫长分析

3 讨论

本试验选择的‘贵州‘矮脚黄鸡’’属仿土鸡类型优质鸡,培育水平较高,生长速度快.而‘兴义矮脚鸡’是地方品种,培育水平相对不高，生长速度相对较慢[17].而且陈明等[18]与朱远春等[19]的研究结果一致表明‘矮脚黄鸡’的屠宰率和胸腿肌率都比‘兴义矮脚鸡’高,说明‘矮脚黄鸡’的产肉性能相对更好.利用‘矮脚黄鸡’中所含的dw基因代替Cp基因来保留‘兴义矮脚鸡’的矮脚性状和优质风味的同时，提高产肉性能，为培育适合市场的品系提供了方向.

因为‘贵州矮脚黄鸡’不含Cp基因，所以在杂交一代中：Cp基因的(+/+)基因型频率和(Cp/+)基因型频率均为50%，不存在(Cp/Cp)基因个体，符合孟德尔遗传规律.本研究在杂交F1代鸡中检测到含有dw基因的杂合个体一共24只，公母各12只，通过引进‘贵州矮脚黄鸡’与‘兴义矮脚鸡’进行杂交，能够将dw基因导入鸡群，但数量较少，有待于扩大样本进行试验.这24只含有dw基因的个体中剔除了cp基因的为19只，这19只个体可用于F1代自交，在F2代再使用分子标记进行早期鉴定，即可得到剔除了Cp基因又为dw基因纯合的个体，这些个体可稳定遗传矮脚性状又不存在胚胎期致死，该方法与传统育种相比可大大的缩短育种进程.

在6周龄以前，‘贵州矮脚黄鸡’胫长都长于‘兴义矮脚鸡’，与查龙应等[20]研究结果一致，而杂交鸡的胫长在两品种之间，这是由于dw基因对胫长的影响是在生长过程中才逐渐表现出来的[21]，不同于Cp基因从胚胎时期就开始影响鸡个体的发育.12周龄后‘兴义矮脚鸡’母鸡胫长才超过‘矮脚黄鸡’母鸡，16周龄后‘兴义矮脚鸡’公鸡的胫长才超过‘矮脚黄鸡’公鸡，与查龙应等[20]的研究结果在8周龄不同，原因可能与饲养条件的不同有关，也可能因为本实验计算的是区分性别的群体胫长.

4 结论

本研究首次采用分子标记辅助选育，在杂交F1代鸡中挑选出了19只既含有dw基因，又不含有Cp基因的个体，经过一代杂交即可剔除Cp基因，传统选育还需进行测交检验，该方法大大提高了育种效率，节约了育种成本和时间.