噬菌体防治嗜水气单胞菌相关疾病的研究进展

成亚辉， 王子艺， 高栋业， 肖 炜， 张仕颖*

(1.云南农业大学 云南省土壤培肥与污染修复工程实验室，云南 昆明 650201； 2.云南大学 云南省微生物研究所， 云南 昆明 650091)

嗜水气单胞菌是一种常见的条件致病菌，可引起两栖动物、爬行动物、鸟类、鱼类和其他动物疾病，甚至感染人类[1-3]。过去几十年，抗生素被普遍应用于治疗细菌性疾病感染，但抗生素的不合理使用会导致多重耐药菌株的出现[4-5]。随着抗生素的治疗效果越来越不明显，加之成本高、污染环境、抗药性增加等一系列问题，人们不得不寻找其他可能的替代疗法。噬菌体是感染和杀灭细菌的病毒，在环境中分布广泛。噬菌体的发现最早可追溯到19世纪90年代，英国科学家Ernest Hanbury Hankin发现印度恒河两岸爆发的霍乱疫情没有迅速蔓延，并随时间的推移自动消失，研究后其认为是人们饮用的恒河水中存在某种可以杀灭霍乱病菌的物质。1915年Edward Twort首次报道关于噬菌体的研究，1917年D’Herelle正式提出噬菌体的概念[6-9]。早在噬菌体被发现初期，就被用于治疗人类和动物感染的细菌性疾病，即噬菌体治疗。D’Herelle提出噬菌体可用于治疗细菌感染后，在1919年用噬菌体制剂治愈4名痢疾患者，证实噬菌体治疗的价值[10]。20世纪40年代，由于人们对噬菌体生物学相关知识的匮乏，加上青霉素的应用带来了抗生素的黄金时代，西方科学家逐渐对噬菌体治疗的研究丧失兴趣，但俄罗斯、格鲁吉亚、波兰等少数东欧国家却将噬菌体治疗沿用至今[6,11]。近年来，由于耐药菌株的大量出现，抗生素治疗效果不尽人意，而噬菌体作为一种天然有效的杀菌剂，具有较高的安全性和有效性，噬菌体治疗重新被科学界重视起来[12-15]。鉴于此，从嗜水气单胞菌的感染、嗜水气单胞菌噬菌体和嗜水气单胞菌噬菌体治疗等方面对嗜水气单胞菌噬菌体及其应用研究现状进行归纳总结，旨在寻找防治嗜水气单胞菌相关疾病可能的替代方案，并为噬菌体治疗的应用奠定理论基础。

1 嗜水气单胞菌的感染

1.1 水产动物感染

嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)为气单胞菌科(Aeromonadaceae)气单胞菌属(Aeromonas)的一种革兰氏阴性菌[16-17]，在淡水、土壤、食品等环境中分布广泛。由该菌引起的最常见疾病为运动性嗜水气单胞菌败血症，可引起多种淡水鱼类出血性败血症、眼球突出、感染性异常水肿和鳍、尾腐烂等症状，同时，嗜水气单胞菌也能感染人类，引起腹泻、败血症等疾病[3,18-19]。1891年，有报道称嗜水气单胞菌可导致蛙的“红腿病”。20世纪80年代，该菌在我国引起鱼病大面积传播，给水产养殖业造成严重危害[20]。1986年，又引发腹泻、败血症、食物中毒等疾病频发[21]。1992年，我国南方各省淡水养殖渔场爆发由该菌引起的败血症[20]，次年，在北京爆发了一起嗜水气单胞菌污染饮用水引起的急性腹泻，发病率高达65%[22]。2001年，该菌感染导致圣劳伦斯河25 000条鲤鱼死亡。2002年，引起印度尼西亚800余t金鱼死亡，直接经济损失近4 000万美元。2007年和2009年，在美国明尼苏达州和阿拉巴马州引发鲶鱼养殖场大量污染，损失鲶鱼近300万磅。2010年，韩国水产养殖业出现鱼类因感染嗜水气单胞菌而大量死亡的现象[23-24]。近几年，泰国养殖的鲶鱼也出现大量由该菌引起的出血性败血症，死亡率高达80%，经济损失严重[25-26]。

1.2 人类感染

嗜水气单胞菌不仅对水产养殖业破坏严重，对人类健康也存在巨大威胁。2001—2011年，浙江大学附属医院从临床患者肠道外分离的所有气单胞菌属中，嗜水气单胞菌占61.8%[27]。2009—2011年，台湾一所医疗中心129例由气单胞菌引起的软组织感染患者中，77例被确定为嗜水气单胞菌感染，占患者总数的59.7%[28]。江丽莉等[29]报道了2例由嗜水气单胞菌导致的坏死性筋膜炎病例。CALLISTER等[30]对几种蔬菜进行了嗜水气单胞菌分布和致病性调查发现，其为潜在的致病来源；任超杰等收集15例感染嗜水气单胞菌病人的分泌物发现，由该菌引起的非肠道感染增多，且该菌具有较高的耐药率[31]。因此，嗜水气单胞菌不仅是水产养殖业中的棘手问题，而且严重威胁人类生命健康，寻找能够预防和治疗嗜水气单胞菌感染的有效手段意义重大。

2 嗜水气单胞菌噬菌体

2.1 嗜水气单胞菌噬菌体的发现及其基因测序

记录在NCBI pubmed的第1株嗜水气单胞菌噬菌体记载于1983年CHOW等[32]发表的关于噬菌体分离和生物学特性的研究。1994年，林业杰等[33]从福建沿海地区外环境标本中分离出25株嗜水气单胞菌噬菌体，并对其中6株进行鉴定，这是我国首次分离到嗜水气单胞菌噬菌体。随着基因工程技术的快速发展，2001年，TETART等[34]完成了第1株嗜水气单胞菌噬菌体Aeh1的全基因组测序；2012年，SHEN等[35]完成第2株嗜水气单胞菌噬菌体CC2的全基因组测序，这也是我国首次完成此类噬菌体的基因测序。

2.2 嗜水气单胞菌噬菌体全基因组序列现状

截止2020年4月1日，GenBank共收录44株嗜水气单胞菌噬菌体的全基因组序列(表1)。这些噬菌体大多从水环境中分离得到，主要来自中国、韩国、波兰、俄罗斯、美国、澳大利亚和印度7个国家。其中，有23株属于肌尾噬菌体科(Myoviridae)，占52.3%；12株属于短尾噬菌体科(Podoviridae)，占27.3%；6株属于长尾噬菌体科(Siphoviridae)，占13.6%；另有Ahp2属于丝状噬菌体科(Inoviridae)，62AhydR11PP和嗜水气单胞菌噬菌体44572基因组则尚未确定分类地位。已报道的嗜水气单胞菌噬菌体基因组大小差异显著，其中肌尾噬菌体科具有较大的基因组，为45～262 kb，且大于200 kb的居多；短尾噬菌体科为30～97 kb，多数为42 kb；长尾噬菌体科基因组大小为45～115 kb；丝状噬菌体科的Ahp2为47 kb；未分类的62AhydR11PP和 44572基因组大小分别为43 kb和102 kb。从核酸结构看， 44株嗜水气单胞菌噬菌体中，只有pAh6-C、2L372X、MJG、LAh6和44572为环状DNA，其余39株均为线状DNA。

表1 GenBank中可用的嗜水气单胞菌噬菌体(截止2020年4月1日)

3 嗜水气单胞菌噬菌体治疗的研究现状

3.1 单一噬菌体治疗

由于噬菌体具有较高的宿主特异性和敏感性，不会对正常微生物菌群造成影响[36]，因此，噬菌体疗法在嗜水气单胞菌防治方面具有潜在优势，在实验或自然感染的动物中可成功治疗嗜水气单胞菌相关疾病，即使只用单一噬菌体治疗，仍有明显的杀菌效果。研究表明，斑马鱼被感染嗜水气单胞菌48 h后死亡率达96.67%，经EASWARAN等[37]分离的对致病嗜水气单胞菌具有强裂解作用的噬菌体pAh-1(MOI=10)处理后死亡率降低50%，证实口服噬菌体pAh-1可大大提高斑马鱼的存活率。为控制由多重耐药嗜水气单胞菌引起的鲤科泥鳅大规模死亡，从首尔汉江分离了2株噬菌体pAhl-C和pAh6-C，并评价其在实验性感染该菌过程中的治疗潜力，结果表明，在2.6×106CFU/fish浓度处理下加入pAhl-C和pAh6-C治疗，鲤科泥鳅的死亡率从39.17%分别降至17.50%和11.67%；在2.6×107CFU/fish浓度处理下加入pAhl-C和pAh6-C治疗，死亡率从100%分别降至26.67%和39.17%，证明噬菌体pAhl-C和pAh6-C能有效预防和治疗嗜水气单胞菌引起的鲤科泥鳅大规模死亡[38]。然而，使用单一噬菌体控制特定病原体，很容易出现耐药菌株[39-41]，菌株产生抗生素耐受的速度比噬菌体快10倍[42]。JUN等[38]研究发现，虽然噬菌体抑菌效果显著，但体外抑菌试验显示，pAhl-C和pAh6-C分别在12 h和6 h时出现细菌再生现象，说明单个噬菌体用于治疗有可能导致耐药菌株的出现。

3.2 混合噬菌体治疗

为了克服单个噬菌体治疗有可能导致耐药菌株出现的局限性，研究者提出噬菌体“鸡尾酒”的想法，即将多个不同特性的噬菌体制成混合制剂。越来越多的研究表明，混合噬菌体治疗是控制多重耐药病原体的有效替代方案[39]。LE等[25]分离到对致病性嗜水气单胞菌具有裂解作用的噬菌体Φ2和Φ5，试验结果表明，与对照18.3%的存活率相比，使用噬菌体混合制剂处理后(MOI=100)，被试鲶鱼的存活率显著提高，达100%，证实利用噬菌体混合制剂控制嗜水气单胞菌败血症的潜在可能性。但是，噬菌体“鸡尾酒”也并不总是比单一噬菌体更有效。HOANG等[26]从鲶鱼中分离到4株嗜水气单胞菌噬菌体，筛选其中2株CT45P和TG25P用于噬菌体治疗，结果表明，由2株噬菌体组成的“鸡尾酒”能有效抑制细菌增殖，但与单一噬菌体处理相比，噬菌体“鸡尾酒”的抑菌效果仅延长1 h左右。导致该现象的原因可能是宿主细菌在接触噬菌体后会进化出不同的噬菌体抗性机制，而有些噬菌体“鸡尾酒”只是不同噬菌体的简单混合，并没有考虑噬菌体所吸附细菌的受体差异[43]。因此，考虑噬菌体联合抗生素治疗将会是非常有价值的方法[44-46]。

3.3 噬菌体和抗生素联合治疗

噬菌体和抗生素可通过不同机制完成杀菌，如果二者联合将可能产生一定协同效应，减少耐药菌株出现[45]。CHANDRARATHNA等[47]从鲤鱼组织中分离出1株噬菌体AHP-1，并比较AHP-1、氯霉素(5 μg/mL)及噬菌体-抗生素联合治疗在体外试验中的抑菌效果，结果表明，单独使用氯霉素3 h后观察到细菌生长，AHP-1在15 h内可抑制细菌生长，联合治疗则在24 h内抑菌效果高于其他2种处理方式；并得出结论，某些情况下低浓度抗生素与噬菌体混合可增强抑菌效果。因此，开发多种噬菌体与低剂量抗生素联合应用可能具有更好的应用前景。

总体而言，目前关于嗜水气单胞菌噬菌体的相关研究还不多，只有少数感染该菌的噬菌体进行了生物学特性研究和裂解性分析，其中包括噬菌体pAh1-C、pAh6-C、pAh-1、CT45P、TG25P、AHP-1、Akh-2和LAh1-10[13,26,37-38,47-48]。另外，噬菌体13AhydR10PP、14AhydR10PP、85AhydR10PP和25AhydR2PP有较宽的宿主域，且其基因组中未发现抗性基因和毒力基因[49]，噬菌体MJG、AhSzq-1和AhSzw-1也未检测到抗性基因或毒力基因[50-51]，这些噬菌体均可作为防治嗜水气单胞菌相关疾病的潜在药物，作进一步探索和研究。

4 研究展望

虽然利用噬菌体治疗嗜水气单胞菌相关疾病优势明显，但目前成熟的应用研究还相对较少。想要让噬菌体治疗达到最佳防治效果，并将其广泛应用到临床治疗中，未来还可从以下几个方面对嗜水气单胞菌噬菌体开展相关研究：一是筛选更适合用于治疗的原始噬菌体，分析噬菌体的生物学特性及基因组信息，了解噬菌体与宿主之间的相互作用方式，考察噬菌体在体外对病原菌的裂解效果，选择潜伏期短、裂解量高、特异性强、理化性质稳定和突变频率低的噬菌体作进一步开发利用；二是通过分子生物学手段对噬菌体进行基因改造，随着分子生物学技术的快速发展，对噬菌体进行遗传学水平的编辑已成为可能[52]，有研究[53-55]通过基因改造技术将噬菌体的部分基因进行替换，成功改变了噬菌体原有的宿主域，未来可在基因编辑筛选优良性状方面作更多尝试；三是制备噬菌体“鸡尾酒”，噬菌体“鸡尾酒”一般具有宿主域广、裂解能力强等特性，可克服单一噬菌体抗菌谱窄的劣势，降低耐药菌株的出现频率，是未来噬菌体治疗的主要发展方向[40-42]；四是加深对噬菌体杀菌机制的认识，弥补噬菌体治疗的不足，噬菌体治疗的基本原理是通过裂解宿主细菌达到杀菌目的，目前应用最多的噬菌体裂解酶为内溶素，可对细胞壁进行溶解并释放毒力因子[11,56-57]，未来这些酶可作为主要成分被用于抗菌性研究中。相信在不久的将来，噬菌体将会凭借其独特的优势，成为治疗嗜水气单胞菌相关疾病的另一条有效途径。