基于SSR分子标记的榧树雄株遗传多样性分析

焦 云， 邬玉芬， 舒巧云

(1.宁波市农业科学研究院 林业研究所， 浙江 宁波 315040； 2.宁波市宁海县林特技术推广中心， 浙江 宁波 315600)

榧树(Torreyagrandis)为红豆杉科植物，雌雄异株，是我国特有珍稀树种，以浙江省绍兴市的会稽山区为主要栽培中心。浙江省香榧栽培面积逐年扩大，宁波、嵊州等地已形成规模化连片种植区。目前，研究主要集中于榧树雌株种质资源收集、遗传多样性分析和果实品质分析等方面[1-4]，对榧树雄株种质资源的综合评价等方面研究报道较少，多数农户缺乏香榧授粉树配置及授粉相关技术指导，对雄榧树保护不力，毁坏严重，因此，开展榧树雄株种质资源的收集和评价工作已迫在眉睫。SSR分子标记技术已经广泛应用于杏[5]、柚[6]、桃[7]、荔枝[8]和榧树[9]等遗传多样性分析、遗传图谱构建等方面，在榧树上的应用主要针对其栽培品种及各种野生资源的遗传多样性进行分析，而对榧树雄株种质的遗传来源及多样性研究涉及甚少。鉴于此，研究利用SSR分子标记综合分析榧树雄株的遗传多样性，为进一步挖掘优良榧树雄株种质资源和杂交育种中亲本的选择奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为50份榧树资源，包括2株雌雄同株、6株雌株及42株雄株。榧树资源原始来源均为绍兴嵊州，2011—2013年期间相继移栽至宁波宁海和余姚等地。至2020年榧树树龄均为11年。50份榧树资源信息见表1。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取、SSR引物合成与PCR扩增 2020年4月分别采集50份榧树无病虫害的嫩叶，使用Ezup 柱式植物基因组 DNA 抽提试剂盒(上海，生工生物工程股份有限公司)提取其基因组DNA。委托上海生工生物工程股份有限公司合成榧树相关SSR引物(课题组前期研究已开发)；PCR扩增反应体系及具体方法参照JIAO等[10]的方法进行。

1.2.2 基因型分型检测与数据分析 取上述扩增产物等比例混合后，委托上海生工生物工程股份有限公司在ABI3730遗传分析仪进行检测。扩增产物片段大小用GeneMapper Software version 3.7(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)进行读数，只统计长度为100～500 bp的扩增产物片段，使用Excel 2007构建数据矩阵表，使用POPGENE 1.32计算所有引物组合的Shannon信息指数和有效等位基因数。基于Dice系数[11]遗传距离，使用非加权组平均法(Unweighted Pair-Group Method with Arithmetic means, UPGMA)及Free Tree 0.9.1.50进行聚类分析，其中bootstrap值设置为1 000，聚类图使用Tree view 1.6.6修改。

表1 50份榧树资源的采集信息

2 结果与分析

2.1 SSR引物的多态性

使用50份榧树资源对SSR引物进行多态性评价，共扩增出48个条带，平均每个引物可扩增8个条带(表2)。此外，平均有效等位基因位点数量和Shannon信息指数分别为3.383 4和 1.442 5。期望杂合度为0.531 5(XF111910)～0.818 4(XF2096)；每个引物组合扩增条带数量为5～11条，其中，XF2096扩增条带数量最多(11条)，多态性指数最高(1.946 7)。

表2 SSR引物多态性信息

2.2 榧树雄株资源的遗传多样性

基于6对SSR分子标记分型产生的48个片段矩阵及遗传距离，采用UPGMA法构建50份榧树资源的遗传亲缘关系聚类树(图1)。不同榧树资源间的遗传相似系数为0.68～0.98，表明50份榧树资源之间存在一定的遗传多样性。当遗传相似系数约为0.68时，可将所有榧树资源分为4个组。A组包含A-1和A-2亚组，A-1亚组包括10份榧树资源，其中包括珍珠榧资源；A-2亚组包括6份榧树资源，均为来自宁波的榧树雄株。B组包含B-1和B-2亚组，B-1亚组包括7份榧树资源；B-2亚组包括4份榧树资源，分别为2020CX-2、2020CX-4雌雄同株和来自嵊州的雄株2020X-5和2020X-6。C组仅包含2份榧树资源，均为来自宁海的榧树雄株。D组包含D-1和D-2亚组，尽管茄榧和细榧等雌株同划分于D-1和D-2亚组，但其均划分于相对独立的分支。由此可见，上述雌株与雄株遗传来源具有一定差异。此外，值得注意的是，50份榧树资源的遗传亲缘聚类与其来源地区存在一定联系，但与其盛花期关系不明显。

3 结论与讨论

榧树为雌雄异株植物，为提升其产量获得更高的经济价值，部分生产单位多采用人工辅助授粉技术措施。然而，由于部分农户贪图采集雄株花粉便利和缺乏可持续经营理念，大肆砍伐雄株，使雄株资源受到极大破坏，部分产区雌雄株比例严重失调，因此，收集和保护雄株种质资源，并开展相关遗传多样性分析与授粉技术研究是当务之急。为挖掘优良榧树雄株种质资源和杂交育种亲本选择奠定基础，运用SSR分子标记技术对50份不同区域来源的榧树资源进行研究，分析榧树雄株的遗传多样性。结果表明，每对SSR引物平均可扩增获得8个条带，高于前期研究结果[12]。由此可见，榧树雄株具有较为丰富的遗传多样性。此外，通过对50份榧树资源进行聚类分析发现，聚类结果与地域来源存在一定的关系，与雄花盛花期没有较为明显的关联性，意味着榧树雄株盛花期具有更为复杂的遗传决定机制。

榧树雄株的性状如花粉量、始花期及花期长短等是香榧生产中雌雄配置的核心理论依据。因此，建立榧树雄株种质资源圃，开展榧树雄株花期、花粉出粉量、生活力等综合评价及授粉优株筛选，探索雄株早期快速鉴定的实验方法，建立和完善榧树人工辅助授粉技术，对于全面提高香榧产量和质量及促进香榧产业的持续健康发展具有重要意义。研究采用SSR分子标记对榧树雄株的遗传多样性进行综合评价，对后续榧树授粉树配置和合理选配亲本以及开展品种选育研究工作具有一定指导意义。