苗药八角枫发酵前后抗炎作用比较及有效部位的筛选*

蒙燕瑶，杜洪志，王小波，吕 丽，吴昭会，李 玮，陈志琳

(贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025)

苗药八角枫为八角枫科植物八角枫Alangiumchinense(Lour．)Harms干燥根，味辛、苦，性微温，有小毒，归肝、心、肾经，具有祛风除湿、舒筋活络、散瘀止痛之功[1]，常用于治疗风湿痹痛、四肢麻木、跌打损伤等。现代药理研究表明，八角枫醇提物、八角枫总碱均能有效地改善大鼠关节的红肿和肿胀，并有效降低炎症指数[2]。八角枫水提液可明显降低CIA大鼠血清中的1L-1β和肿瘤坏死因子(TNF)-α水平[3]，而八角枫中的水杨苷及其衍生物八角枫苷A、龙胆酸-5-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、异它乔糖苷均具有较强的抗炎活性[4-5]。

但是八角枫毒性较大，且与剂量呈正相关，以至临床使用中因服用过量而中毒死亡的情况时常发生，从而阻碍了这一民族药的开发和利用。通过前期实地调研发现，我省黔南、黔东南部分苗族地区，常通过“半发酵”的方式炮制八角枫，而目前，有关该民族药发酵炮制的相关研究未见报道。基于此，本研究采用“固态发酵”法炮制苗药八角枫，通过小鼠棉球肉芽肿抗炎试验，研究发酵前后抗炎作用变化并筛选其抗炎有效部位，从而评价“固态发酵法”炮制八角枫的可行性，并初步确定抗炎有效部位，研究结果为进一步探讨苗药八角枫发酵炮制作用机理及其减毒存效机制奠定研究基础。

1 材料

1.1 动物

KM小鼠，SPF级，雌雄各半，体重18～22 g，均购于长沙市天勤生物技术有限公司，生产许可证号：SCXK(湘)20140010，SCXK(湘)20140011。

1.2 试药

乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等均为分析纯。羧甲基纤维素钠(成都金山化学试剂有限公司，批号：20140302)；醋酸泼尼松(浙江仙琚制药有限公司，批号：190231)；水合氯醛(雷根生物有限公司，批号：01/2020)；碘伏(德州安捷高科消毒制品有限公司，批号：20171002)；0.9%氯化钠注射液(贵州科伦药业有限公司，批号：H2016004)，蒸馏水为实验室自制。。

八角枫须根购自贵州省毕节市药材市场，经贵州中医药大学药学院魏升华教授鉴定为八角枫(Alangiumchinense(Lour.)Harms)的根。

2 方法与结果

2.1 八角枫“固态发酵”炮制品的制备

根据相关研究报道[6-8]，结合优选的发酵工艺制备八角枫发酵炮制品。取八角枫药材干品，净制、打粉，制备八角枫粗粉(20目)。取面粉、玉米粉、米糠按等比混合，作为发酵辅料备用。辅料组为药物∶辅料=1∶3，无辅料组为药物∶葡萄糖=1∶0.2，称量药材重量5%的酵母菌，加入10 mL蒸馏水活化1 h，两组药物分别混合均匀，加入适量蒸馏水，润透，置于蒸锅中蒸制1.5 h，放冷。两组药物各取一半作为辅料对照品组和无辅料对照品组，直接置于55 ℃烘箱中烘干备用。剩余部分分别加入活化的酵母菌液，搅拌均匀，盖上盖子，置于恒温30 ℃的培养箱中培养7 d，取出置于55 ℃烘箱中烘干，得到辅料发酵品和无辅料发酵品，备用。

2.2 八角枫生品及发酵品醇提取物的制备

取八角枫生品及发酵炮制品各500 g，以8倍量80%的乙醇回流提取1 h，过滤，滤渣用6倍量80%的乙醇回流提取，每次1 h，提取2次，合并3次提取液，回收乙醇，所得稠膏置于水浴锅上挥干，4 ℃冰箱保存备用。

2.3 八角枫生品及发酵品不同极性部位的制备

根据2.2项下的方法制备八角枫生品和辅料发酵品的醇提物流浸膏，挥尽乙醇，加水制成混悬溶液，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取(每种溶剂均250 mL×4)，得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取部分，剩下为水部分。55 ℃减压回收溶剂后，根据生药量，加入0.5%的CMC-Na水溶液进行溶解，得到不同极性部位的提取液，4 ℃冰箱保存备用。

2.4 各给药组溶液配制

八角枫的常规用量为3～9 g，取人的用量为9 g，体重60 kg，小鼠以20 g计，按照人与小鼠换算系数计算，得出小鼠给药剂量为1.8 g/kg。

阳性药醋酸泼尼松的给药量以说明书用量为基础，以人与小鼠换算系数计算，得出小鼠给药剂量为0.7 mg/mL。各给药组，均用0.5%羧甲基纤维素钠溶液(CMC-Na)配制成相应浓度，分别置于4 ℃冰箱保存备用。

2.5 八角枫发酵前后抗炎试验

取实验小鼠70只，随机分为7组，即(1)无辅料无发酵组、(2)无辅料发酵组、(3)生品组、(4)有辅料无发酵组、(5)有辅料发酵组、(6)阳性药组、(7)模型对照组，每组10只。模型对照组给予等量0.5%CMC-Na溶液。均为灌胃给药(0.1 mL/10 g)。实验当日给药1 h后，腹腔注射4%水合氯醛溶液(0.1 mL/10g)，麻醉后，将小鼠腹部手术切口区的被毛剪除，用75%的乙醇擦拭消毒，剪开皮肤，用眼科镊于小鼠左右腋下分别植入一个高压灭菌棉球(10 mg±1 mg)，缝合伤口并涂抹碘伏消毒，常规饲养备用。次日，给各实验小鼠伤口处涂抹碘伏，预防伤口感染，术后每天给药1次，连续14天，于第14 d给药1 h后脱颈处死，摘取棉球肉芽肿，于70 ℃烘箱中干燥4 h，称重。抑制率(%)=[(模型对照组肉芽肿干重均值-给药组肉芽肿干重均值)/模型对照组肉芽肿干重均值]×100%。

2.6 八角枫发酵前后抗炎有效部位筛选

取实验小鼠108只，随机分为12组，即生品总提物组、生品石油醚组、生品乙酸乙酯组、生品正丁醇组、生品水部位组、辅料发酵品总提物组、辅料发酵品石油醚组、辅料发酵品乙酸乙酯组、辅料发酵品正丁醇组、辅料发酵品水部位组、模型对照组、空白组，每组9只。其余操作同2.5项。

2.7 统计方法

2.8 八角枫发酵前后抗炎作用比较

无辅料发酵组、生品组、有辅料发酵组与模型对照组相比均能显著减少肉芽组织的增生(P<0.01)，其中有辅料发酵组对肉芽肿的抑制率为33.33%，是除阳性对照外，抑制率最高的组别。关于各组小鼠的肉芽肿情况，结果见表1。

表1 各组小鼠肉芽肿情况分析比较Tab.1 Comparison of granuloma in each group of mice

2.9 八角枫发酵前后各部位抗炎作用比较

2.9.1 各部位对棉球诱导的肉芽重量的影响

八角枫生品总提物、生品石油醚、生品乙酸乙酯、生品正丁醇、辅料发酵品总提物与模型对照组相比，均能减少肉芽肿增生(P<0.05)，其中对肉芽肿的抑制率最高的是生品乙酸乙酯组，抑制率达到30.56%(P<0.01)。各组小鼠的肉芽肿情况，结果见表2。

表2 八角枫炮制前后各部位抗炎试验结果分析Tab.2 anti-inflammatory test results of Alangium chinensebefore and after processing

2.9.2 脏器重量、脏器系数分析

比较给药后雌雄小鼠脏器重量及脏器系数，结合相关文献分析药物是否有性别趋势。给药后，脾、肺重量差异由不显著(P>0.05)变为极显著(P<0.01)。肝系数、肾脏系数差异由不显著(P>0.05)变为极显著(P<0.01)，脾系数由不显著(P>0.05)变为显著(P<0.05)，体重差异由不显著(P>0.05)变为极显著(P<0.01)。结果见表3、表4。

表3 给药组小鼠脏器重量、脏器系数测定结果(n=9)Tab.3 Measurement results of organ weight and organcoefficients of mice in the experimental group

续表3

表4 对照组小鼠脏器重量、脏器系数、肉芽重量测定结果(n=9)Tab.4 Measurement results of organ weight，organcoefficients and granuloma weight of mice in the control group

3 结果与讨论

抗炎试验结果表明，八角枫发酵品的抗炎作用显著高于其生品，可见应用“固态发酵”炮制八角枫能达到增效的目的，且有辅料发酵炮制效果比无辅料发酵好，提示辅料是影响炮制效果的主要因素之一，为其发酵炮制工艺的优化提供重要依据。八角枫生品乙酸乙酯部位对棉球肉芽肿的抑制率最高(P<0.01)，发酵后，石油醚部位对棉球肉芽肿的抑制率最高(P>0.05)，即“固体发酵”后其有效部位发生了改变，但其发酵炮制作用机理，还需结合有效部位物质变化进一步研究。药物对雌雄小鼠的体重、脏器及脏器系数的影响具有显著性差异，提示药物的毒性作用或具性别趋势，但是雌雄小鼠肉芽重量无显著性差异(P>0.05)，可见，药物的抗炎效果不具有性别趋势。

为考察体重的增加是否会直接导致小鼠腋下脂肪增厚，间接影响肉芽的重量，本次实验，小鼠饲养过程均自由饮水饮食，使后期小鼠体重普遍增高。采用SPSS22.0统计分析软件对体重和肉芽重量进行相关性分析，结果显示体重和肉芽重量的相关系数为0.063，且不显著(P=0.459)，即体重和肉芽重量无显著相关性，小鼠体重的增加不会影响抗炎试验结果。

八角枫作为“消痹灵合剂”“风湿定片”“枫荷梨祛风湿酒”等制剂的主药，临床疗效确切，但其毒性较大，且毒性物质基础及作用机制尚不明确，至今为止，除控制药用剂量外，尚无有效措施保证其用药安全。通过前期实地调研发现，我省黔南、黔东南部分苗族地区，常通过“半发酵”的方式炮制八角枫，但炮制效果及其作用机制均有待科学考证。

发酵作为传统的炮制工艺，用其炮制毒性中药，以达到减毒增效的例子比比皆是[9-11]，本研究以发酵炮制为切入点，应用“固态发酵”法炮制八角枫，并采用小鼠棉球肉芽肿抗炎试验评价其炮制效果，结果显示“固态发酵”能够提高八角枫的抗炎作用，而通过八角枫发酵前后各部位抗炎作用比较，初步确定乙酸乙酯为其抗炎有效部位，发酵后，有效部位发生改变，但仍具抗炎作用，其发酵炮制作用机理及抗炎机制有待进一步研究。