检验用大肠杆菌K88纤毛抗原的纯化及其单因子血清制备与质量控制方法研究

彭国瑞， 蒋 菲， 王秀丽， 彭小兵， 李 建， 李旭妮， 李俊平， 张 媛

(1.中国兽医药品监察所， 北京海淀100081 ； 2.中国农业大学动物医学院， 北京海淀100193 ； 3.中国动物疫病预防控制中心， 北京大兴102600)

目前，我国用于预防仔猪黄痢的疫苗有仔猪大肠埃希菌病三价灭活疫苗和仔猪大肠杆菌病(K88、K99、987P)、产气荚膜梭菌病(C型)二联灭活疫苗等，年产量约380万头份。这类疫苗的效力检验主要采用反向间接血凝试验(RIHA)测定大肠杆菌K88、K99和987P纤毛抗原的RIHA效价，该方法需使用相应纤毛抗原单因子血清[1]，国外采用的ELISA方法也需要纤毛抗原多克隆抗体和单克隆抗体[2]。但现有方法[3-4]制备这3种单因子血清要求抗原纯度高、免疫抗原剂量大，同时也存在血清效价不易提高、质量不易稳定控制的问题。因此，研究一种效价高、特异性好、制备方法简便、质量可控的纤毛抗原单因子血清标准品，对于提高疫苗检验结果的一致性和稳定性都十分必要。本研究通过高密度发酵获得了仔猪大肠杆菌培养物，优化了K88纤毛抗原的纯化方法，制备了免疫血清，并对制备过程进行质量控制，为兽用生物制品检验用标准品的研制提供试验基础。

1 材料与方法

1.1 菌种 仔猪大肠杆菌灭活疫苗检验用含K88纤毛抗原的大肠杆菌CVCC196(C83902)，由中国兽医药品监察所保存。

1.2 试剂 改良Minca琼脂、改良Minca肉汤干粉、PBS缓冲液，均由北京中海生物科技公司提供；BCA蛋白定量试剂盒，购自北京康为世纪公司；K88、K99、987P纤毛抗原单因子阳性血清、弗氏佐剂，均由本实验室制备；甘油、柠檬酸、硫酸氨、脱氧胆酸钠(Na-DOC)等为国产或进口试剂纯。……