夹心ELISA法测定基因重组球虫表达异源蛋白的水平

罗伏兵， 徐发荣， 王慧强， 马志军， 汤新明， 刘贤勇， 索 勋， 刘晓冬

(1．北京市动物疫病预防控制中心， 北京大兴102629 ； 2.中国农业大学动物医学院， 北京海淀100193)

艾美耳球虫(Eimeria)基因组约60 Mbp，可编码8 000～9 000个蛋白，组分复杂[1]。分析异源抗原在基因重组球虫混合组分中所占比重是优化抗原表达水平的基础。常规蛋白定量方法主要是基于蛋白分子间化学键或氨基酸特性等建立的检测蛋白总量的方法，而无法满足检测混合蛋白组分中某一特定/单一蛋白的含量。免疫学检测方法利用抗原抗体特异性的结合反应能够准确检出复杂组分中特定蛋白抗原或抗体，并能实现定量或半定量检测的目的。ELISA是最常用的免疫学检测方法之一，具有操作简便、灵敏度高等优势。本试验以表达荧光蛋白的基因重组球虫为模型，利用荧光蛋白特异性的抗体，建立检测基因重组球虫可溶性蛋白中荧光蛋白含量的夹心ELISA方法，为评估基因重组球虫表达异源抗原的含量和优化其作为疫苗载体的研究提供了科学依据； 同时也为其他类型疫苗载体或相关研究提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 虫株与试剂 本文所用野生球虫株、基因重组球虫株EtM2e[2]和EtER[3]，均由中国农业大学动物医学院国家动物原虫实验室保存与扩繁。兔源黄色荧光蛋白多克隆抗体(Rabbit polyclonal to GFP,Proteintech)、鼠源黄色荧光蛋白单克隆抗体(Mouse monoclonal to GFP,Beyotime)、HRP标记的羊抗鼠IgG二抗(Proteintech)及BCA蛋白定量试剂盒均为商品化试剂。黄色荧光蛋白对照品系经原核表达、纯化产物，并测定浓度。……