宫颈鳞癌组织中CEMIP、β-catenin、Cyclin D1的表达变化及其意义

何洋，张蓓，龙玲艳

1徐州医科大学研究生学院，江苏徐州 221000；2徐州医科大学徐州临床学院

宫颈癌(CC)是常见的生殖系统恶性肿瘤，严重威胁女性生命安全[1]。正常宫颈组织→宫颈上皮内瘤变(CIN)→CC进展不但涉及高危型人乳头瘤病毒持续感染、基因组学、表观遗传修饰的参与，最近发现多种癌基因激活、抑癌基因失活和一系列信号通路异常也发挥着重要的作用[2]，因此深入了解CC致病基因对探索CC发生机制、诊断治疗、预后评估意义重大。细胞迁移诱导的透明质酸结合蛋白(CEMIP)又称KIAA1199蛋白，最初被认为是一种内耳蛋白，其突变是造成非综合征听力损失的原因之一，近年研究发现CEMIP是一种Wnt调控蛋白，广泛参与肿瘤细胞分化、增殖、侵袭转移等过程[3]。β-连环蛋白(β-catenin)是Wnt/β-catenin信号通路核心蛋白，通过上调靶基因Cyclin D1的表达从而诱导肿瘤细胞增殖失控[4]。细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)与细胞增殖密切相关，正向精密调控G1/S期的转化，在肿瘤中经常被上调或扩增[5]。近年有关CEMIP在激活Wnt/β-catenin信号通路，调控下游靶基因(c-myc、Cyclin D1)的表达，从而导致肿瘤发生的作用中日渐受到关注，但目前鲜有在宫颈鳞癌中的相关报道。2019年12月-2020年5月，我们观察了宫颈鳞癌组织中CEMIP、β-catenin、Cyclin D1的表达变化，并探讨其意义。

1 材料与方法

1.1 材料 收集2013年1月—2015年1月徐州市中心医院病理科存档的宫颈组织蜡块186例份。蜡块中宫颈鳞癌组织96例份，病例均经病理证实，且均未行放化疗或其他药物治疗；纳入标准：病理确诊，临床资料完善，获得患者知情同意并进行随访(包括门诊、短信及电话随访)；排除标准：来源其他恶性肿瘤或转移癌，术前进行放化疗或其他治疗；患者年龄22～77岁，平均年龄48.01岁；年龄<50岁54例，≥50岁42例；FIGO分期[6]Ⅰ期56例，Ⅱ期32例，Ⅲ+Ⅳ期8例；肿瘤分化程度为高分化9例，中分化74例，低分化13例；肿瘤 直径<4 cm 79例，≥4 cm 17例；浸润深度<1/2肌层59例，≥1/2肌层37例；SCC值<2.5 ng/mL 49例，≥2.5 ng/mL 47例；无淋巴结转移68例，有淋巴结转移28例。Ⅱ～Ⅲ期CIN组织30例份，患者年龄22～69岁，平均年龄41.93岁。Ⅰ期CIN组织30例份，患者年龄22～65岁，平均年龄42.53岁。慢性宫颈炎组织30例份，患者年龄32～66岁，平均年龄47.26岁。本研究征得患者及家属知情同意并签署知情同意书，并获得徐州市中心医院伦理委员会批准。

1.2 宫颈组织CEMIP、β-catenin、Cyclin D1检测方法 取各宫颈组织标本，在10%甲醛中浸泡固定，石蜡包埋，按照4 μm厚度连续切片。将石蜡切片进行70 ℃烤片1 h、二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡2次，每次10 min，梯度乙醇100%→95%→85%→75%→50%各5 min，柠檬酸盐高温修复抗原，内源性过氧化物酶阻断剂室温孵育10 min。鼠抗人CEMIP单抗，按照1∶75抗体稀释液稀释后4 ℃孵育过夜，37 ℃复温45 min，滴加反应增强剂，孵育二抗后进行DAB显色，苏木素复染，酒精梯度(50%→75%→85%→95%→100%)各5 min脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜观察。β-catenin、Cyclin D1采用上述同样的方法进行检测，β-catenin与抗体稀释液按1∶50配比，Cyclin D1与抗体稀释液按1∶75配比。以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为空白对照。阳性结果判定标准：CEMIP阳性结果为棕黄色颗粒表达于细胞质中；β-catenin正常表达于细胞膜上，阳性结果为棕黄色颗粒异位表达于细胞质和(或)细胞核中；Cyclin D1阳性结果为棕褐色颗粒表达于细胞核中。免疫组化结果由2名经验丰富的病理科医生采用双盲法进行判读计分，在高倍镜(×400)下随机选取10个视野，每个视野计数100个细胞，按阳性细胞所占比例及染色强度计分：①阳性细胞比例：阳性细胞比例<5%记0分，5%～25%记1分，26%～49%记2分，50%～75%记3分，>75%记4分；②染色强度：无着色记0分，淡黄色记1分，棕黄色记2分，棕褐色记3分；总得分=阳性细胞比例×染色强度，>3分为阳性表达，≤3分为阴性表达[7]。

1.3 随访方法 对96例宫颈鳞癌患者以门诊、短信、电话等方式进行随访，随访指标包括患者术后生活质量、是否行辅助治疗(放化疗、药物)、是否定期复查、是否有转移灶形成及复发、是否失访(拒绝随访、失去联系、死于该病或其他疾病)等，并对收集的结果进行生存分析。以患者开始治疗的时间为随访起始时间，2020年4月30日为随访截止时间。

1.4 统计学方法 采用SPSS23.0统计软件。计数资料比较采用χ2检验，CEMIP、β-catenin、Cyclin D1间的相关性分析采用Spearman相关分析法，Kaplan-Meier生存分析法分析上述三指标表达与宫颈鳞癌患者生存期的关系,Cox回归分析法分析宫颈鳞癌患者预后的危险因素。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各宫颈组织CEMIP、β-catenin、Cyclin D1阳性率比较 各宫颈组织中CEMIP、β-catenin、Cyclin D1阳性率比较见表1，CEMIP、β-catenin、Cyclin D1在各宫颈组织中的表达情况见图1～图3。

表1 各宫颈组织中CEMIP、β-catenin、Cyclin D1阳性率比较(%)

注：A为慢性宫颈炎组织，B为Ⅰ期CIN组织，C为Ⅱ～Ⅲ期CIN组织，D为宫颈鳞癌组织。

注：A为慢性宫颈炎组织，B为Ⅰ期CIN组织，C为Ⅱ～Ⅲ期CIN组织，D为宫颈鳞癌组织。

注：A为慢性宫颈炎组织，B为Ⅰ期CIN组织，C为Ⅱ～Ⅲ期CIN组织，D为宫颈鳞癌组织。

2.2 CEMIP、β-catenin、Cyclin D1表达与宫颈鳞癌临床病理参数的关系 CEMIP、β-catenin、Cyclin D1表达与宫颈鳞癌临床病理参数的关系见表2，由表2可知，CEMIP、Cyclin D1阳性表达与宫颈鳞癌FIGO分期、分化程度、浸润深度、淋巴结转移有关，β-catenin阳性表达与宫颈鳞癌FIGO分期、分化程度、淋巴结转移有关(P均<0.05)。

2.3 宫颈鳞癌组织中CEMIP、β-catenin、Cyclin D1表达的相关性 宫颈鳞癌组织中CEMIP与β-catenin、Cyclin D1表达呈正相关(r分别为0.301、0.453，P均<0.05)，β-catenin与Cyclin D1表达呈正相关(r为0.495，P<0.05)。

2.4 CEMIP、β-catenin、Cyclin D1表达与宫颈鳞癌患者生存及预后的关系 CEMIP阳性、阴性表达者5年生存率分别为26.5%、97.9%，β-catenin阳性、阴性表达者5年生存率分别为50.0%、95.8%，Cyclin D1阳性、阴性表达者5年生存率分别为47.8%、96.3%，两者比较，P均<0.05。宫颈鳞癌患者预后单因素分析结果见表3，由表3可知，FIGO分期、分化程度、浸润深度、SCC值、淋巴结转移及CEMIP、β-catenin、Cyclin D1阳性表达是宫颈鳞癌患者预后影响因素；宫颈鳞癌患者预后多因素分析结果见表4，由表4可知，淋巴结转移及CEMIP、β-catenin、Cyclin D1阳性表达是宫颈鳞癌患者预后危险因素。

表3 宫颈鳞癌患者预后单因素分析结果

表4 宫颈鳞癌患者预后多因素分析结果

3 讨论

宫颈鳞癌占CC的75%～80%，早期主要临床表现为接触性出血、阴道流液等，晚期可发展为输尿管梗阻、尿毒症、癌栓脱落、恶病质等全身衰竭症状。虽然宫颈筛查不断普及，但宫颈鳞癌的发生率和病死率仍较高，积极寻找高效敏感的肿瘤标志物刻不容缓。目前，Wnt/β-catenin信号通路在CC中发挥促癌作用明确，因此调控该通路相关蛋白的因子可为CC治疗提供新思路。

CEMIP位于15q25位点，该位点是多种肿瘤富集区域，现已发现其在结直肠癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌[8]等恶性肿瘤中高表达，并与癌症进展和不良预后密切相关。CEMIP可协调Wnt信号通路调控上皮间质转化，促进肿瘤细胞增殖、侵袭和癌症扩散等。在结直肠癌中沉默CEMIP会引起β-catenin表达降低，改变细胞周期，降低细胞增殖能力，同时发现CEMIP与Cyclin D1表达呈正相关，敲除CEMIP后Cyclin D1下降较通路中其他因子更明显[9]，因此CEMIP可能是治疗恶性肿瘤的一个新靶点。2019年研究者首先发现了外泌体CEMIP蛋白促进脑转移中的癌细胞定植现象，即在敲除CEMIP的动物模型中，有脑转移倾向的细胞不能在脑细胞中定植，提示靶向外泌体CEMIP可能成为预防和治疗脑转移的未来途径[10]。研究显示，CEMIP能通过参与PI3K-Akt介导的EMT，导致肿瘤恶性转化[11]。XU等[12]发现，结直肠癌中CEMIP蛋白量表达高于正常组织，且主要表达于细胞质和细胞核中。SHOSTAK等[13]发现，CEMIP在CC中呈异常高表达，其通过EGFR途径诱导CC细胞增殖、侵袭转移，在Ⅲ期CIN中的阳性表达略高于CC。本研究显示，宫颈鳞癌组织中CEMIP阳性率高于Ⅰ期CIN和慢性宫颈炎，Ⅱ～Ⅲ期CIN阳性率高于慢性宫颈炎；CEMIP阳性表达与宫颈鳞癌FIGO分期、分化程度、浸润深度、淋巴结转移密切相关；上述结果提示，CEMIP在宫颈鳞癌形成过程中扮演着促癌基因的作用。本研究还发现，宫颈鳞癌组织中CEMIP与β-catenin、Cyclin D1表达呈正相关，提示CEMIP可能通过调控β-catenin、Cyclin D1的表达参与宫颈鳞癌的癌变过程，我们推测CEMIP可成为宫颈鳞癌患者潜在的治疗靶点，但具体作用机制还有待于进一步研究。

Wnt/β-catenin信号通路是肿瘤研究中的经典通路，异常活化可诱导肿瘤分化失控、侵袭转移、耐药等过程，阻断Wnt信号通路可以抑制肿瘤发生。β-catenin位于3p21上，在多种恶性肿瘤中表达上调[14]，在正常成熟细胞中，β-catenin大部分位于细胞膜上，而在肿瘤细胞中，Wnt信号通路被激活，β-catenin与该通路上的轴蛋白、糖原合酶激酶3β、大肠腺瘤样蛋白等形成的复合体不能被泛素化降解，β-catenin从胞膜上异位至胞质和胞核中，与细胞核内转录因子TCF/淋巴样增强因子LEF家族成员相互作用，增加控制细胞分裂和生长的关键Wnt靶基因(Cyclin D1、c-myc)的表达，从而启动肿瘤细胞的恶性增殖[15]，因此针对Wnt/β-catenin信号传导是可能治疗癌症的一种有前途的策略。LI等[16]发现，β-catanin的高表达参与了乳腺癌的恶性增殖和浸润转移，降低β-catenin水平可以抑制肿瘤生长。LIN等[17]发现，HBX诱导的miR-5188损伤FOXO1刺激β-catenin核转位，导致肝癌的肿瘤扩散。随着宫颈病变进展，β-catenin表达增强并异位至胞质或胞核中，且与肿瘤分级、淋巴结转移、预后等密切相关，在一定程度上反应宫颈鳞癌的恶性程度，可作为宫颈鳞癌患者预后的指标[18]。本研究显示，宫颈鳞癌组织β-catenin阳性率显著高于CIN和慢性宫颈炎，β-catenin阳性表达与宫颈鳞癌FIGO分期、分化程度、淋巴结转移密切相关，充分体现了β-catenin在宫颈鳞癌病变进展过程中的致癌作用，抑制β-catenin的表达可减少宫颈鳞癌的发生。

Cyclin D1是Cyclins家族成员之一，在细胞周期G0期开始合成，G1中期达高峰，S期开始降解并维持低水平，与细胞周期素依赖性激酶和周期素依赖性激酶抑制因子共同调节细胞周期，对于维持细胞生长发育平衡意义重大，其异常表达会导致G1期明显缩短，导致细胞恶性增殖[19]。Cyclin D1是目前公认的Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因，大量实验表明Wnt/β-catenin通路激活后Cyclin D1表达上调；Cyclin D1蛋白阳性表达与子宫内膜癌组织学分级、临床分期呈正相关，患者预后较差[20]。丁玉梅等[21]发现，CIN和CC中Cyclin D1表达升高，且Cyclin D1高表达与CC患者临床分期高、分化程度低、淋巴结转移显著相关，提示Cyclin D1有潜在的评估和预后价值。LI等[22]发现，通过靶向Cyclin D1可抑制CC细胞增殖，减弱细胞成瘤性和肿瘤侵袭转移等。本研究显示，宫颈鳞癌组织中Cyclin D1阳性率显著高于CIN和慢性宫颈炎，Ⅱ～Ⅲ期CIN组织中Cyclin D1阳性率显著高于慢性宫颈炎；Cyclin D1阳性表达与宫颈鳞癌FIGO分期、分化程度、浸润深度、淋巴结转移密切相关，提示Cyclin D1可作为宫颈鳞癌治疗的分子靶点。

本研究还发现，CEMIP、β-catenin、Cyclin D1阳性表达患者5年生存率较阴性患者显著降低，CEMIP、β-catenin、Cyclin D1亦是宫颈鳞癌患者预后的独立危险因素，因此我们推测CEMIP、β-catenin、Cyclin D1可作为宫颈鳞癌的有效预测指标。

总之，宫颈鳞癌组织中CEMIP、β-catenin、Cyclin D1表达升高，上述三指标可作为宫颈鳞癌的有效预测指标及潜在治疗靶点。