红莓和黑莓叶黄酮类化合物抗氧化活性的比较研究

蔡成林，黄庭海，张青峰

（遵义医科大学珠海校区，广东珠海 519041）

我国树莓资源丰富，根据果实成熟时的颜色，可以分为黑树莓、黄树莓和红树莓，果实中均含有黄酮类化合物，有着较强的抗氧化活性，无毒副作用，具有去除游离基、降低血压、预防癌症等明显药理效果。

本试验从红莓叶和黑莓叶中提取具有抗氧化作用的黄酮类化合物，并通过吸收光度减弱的程度来评价自由基被消除的情况。抗氧化剂除去游离基的作用愈好，代表抗氧化活性愈强。为了开发新的天然食品抗氧化剂，对它们的抗氧化活性进行了实验对比。

1 材料与方法

1.1 试剂与药品

芦丁标准品，上海金穗生物科技有限公司；盐酸，上海市氯碱化工股份有限公司；氢氧化钠，广州旭观化工有限公司；亚硝酸钠，武汉梦吉股份有限公司；硝酸铝，太阳欣立上海分公司；无水乙醇，武汉市百利瑞化工有限公司；石油醚，浙江自贸易区正拓石油化工有限公司；双氧水，山东瑞泰科技股份有限公司；邻苯三酚，南京道斯夫科技有限公司；磷酸二氢钠，潍坊市金海化工有限公司；邻二氮菲，济宁百川化工有限公司；羟基氨基甲烷，天津市大茂化学试剂厂；二丁基羟基甲苯（BHT），国药集团化学试剂有限公司；抗坏血酸（VC），浙江一诺生物科技有限公司。

1.2 实验仪器

BSA124S精密电子天平，深圳市林涛仪器有限公司；C-20玻璃仪器气流烘干器，上海贝仑仪器有限公司；SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵，上海霓玥仪器有限公司；HF-56数字恒温水浴锅，上海贺范仪器有限公司；7415紫外可见分光光度计，上海霓玥仪器有限公司；DFY-200C高速粉粹机，温岭市林大机械有限公司。

1.3 黄酮化合物的提取

红莓、黑莓叶粉碎后烘干，精密称量获取10 g，分别放在500 mL圆底烧瓶之中，加入400 mL浓度为75%的乙醇溶液，在75 ℃的水浴之中提取1.2 h后真空抽滤，滤液加水稀释至100 mL。

1.4 黄酮含量的测定

1.4.1 标准曲线测定

精密称量获取芦丁10 mg，加适量75%的乙醇，微热使之溶解，置100 mL容量瓶中定容，摇匀后放至自然冷却，得到标准芦丁乙醇溶液。分别取溶液 0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL置于50 mL容量瓶中，加5% NaNO21 mL,摇匀，放置6 min；加10% AI(NO3)31 mL，摇匀，放置6 min；加4% NaOH 8 mL，混匀，用75%乙醇稀释至刻度，放置15 min后用紫外分光光度计在510 nm波长下测定吸光值，绘制标准曲线，如图1所示。测得吸光度Y与浓度X的标准曲线方程为Y=10.561X-0.001 8，R2=0.999 5。

1.4.2 黄酮总含量的测定方法

利用分光光度计测定总黄酮含量，分别获取提取液各0.2 mL于50 mL容量瓶中，用75%乙醇补充至25 mL，加5%的NaNO21 mL，放置6 min；加10%AI(NO3)31 mL，摇匀，放置6 min；加 4% NaOH 8 mL，混匀，用75%乙醇稀释至刻度，放置15 min后用紫外分光光度计在510 nm波长下测定吸光值。记录吸光值在0～1.0以内为有效。利用标准曲线计算黄酮总含量。

1.5 抗氧化性的检测

1.5.1 羟基自由基清除率测定

于6只试管中各加入1 mL 0.75 mmol/L邻二氮菲无水乙醇溶液、2 mL 0.2 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS，酸碱值7.4）和1 mL蒸馏水，充分混合均匀后加1 mL新配制的0.75 mmol/L硫酸亚铁溶液，混合均匀；6支试管中依次加入新配制的0.01%双氧水、蒸馏水、0.2 mg/mL的红莓总黄酮提取液、0.2 mg/mL的黑莓总黄酮提取液、二丁基羟基甲苯、维生素C各1 mL；于37 ℃水浴加热1 h后，在536 nm处测吸光度，分别记为A1（试管中加入双氧水的吸光度）、A2（试管中加入蒸馏水的吸光度）、A3（红莓和黑莓叶提取液的吸光度）、AVC（维生素C的吸光度）、ABHT（二丁基羟基甲苯的吸光度），每组重复3次，根据公式（1）计算清除率。改变红莓总黄酮提取液、黑莓总黄酮提取液、二丁基羟基甲苯、维生素C的浓度（1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL），测定不同浓度下的清除率。

1.5.2 超氧自由基抑制率测定

将Tris-HCl缓冲液（pH 8.2）和邻苯三酚溶液（45 mmol/L）分别水浴（25 ℃）10 min，各取5 mL混合后摇晃均匀，于325 nm即刻测量吸光度（A0），隔0.5 min再测一次吸光度，计算邻苯三酚的自氧化率，自氧化速度控制在0.060～0.065 min-1，常规以测量确定3.5 min平均计。增加试样后氧化率测量方法：取5 mL Tris—HCl缓冲液（pH 8.2），加入待测试样5～20 μL，50 mol/L邻苯三酚溶液5 μL，摇晃均匀，即刻测定吸光度值（A），每组重复3次，根据公式（2）计算超氧自由基抑制率。空白管为酸碱值为8.2的Tris—HCl缓冲液。

2 结果与分析

2.1 红莓和黑莓提取液中黄酮总含量

如表1所示，红莓、黑莓提取液黄酮总含量分别为14.2 mg/mL、18.6 mg/mL，且吸光度SD值表明实验随机误差较小，实验重现性较好。

表1 红莓、黑莓提取液吸光度值及黄酮总含量

2.2 羟基自由基清除率的测定结果

由图2知，红莓和黑莓提取物对羟游离基有一定的除去效果，低浓度时清除效果不显著，高浓度时清除效果较强，在一定浓度范围内提取物浓度与清除率呈正相关；且羟基自由基清除率的大小为红莓提取物＞黑莓提取物＞维生素C＞二丁基羟基甲苯。

图2 黄酮类化合物清除羟基自由基能力的比较

2.3 超氧自由基清除率的测定结果

由图3知，红莓和黑莓提取物对邻苯三酚自氧化形成的超氧负离子游离基有一定的除去效果。在一定范畴之内，提取物浓度与清除率呈现正相关态势。低浓度时，对邻苯三酚自氧化的约束效果较弱，但在较高浓度时，其约束效果明显。

图3 黄酮类化合物清除超氧自由基能力的比较

黄酮类化合物通过酚羟基与游离基反应产生较为平稳的半醌式自由基构造，使其具有抗氧化活性，羟基是否能产生较为平稳的游离基构造代表其抗氧化活性的强弱，决定其抗氧化活性的主要因素是B环上邻二酚羟基的存在与否。2种莓叶提取液有着不一样的抗氧化活性，是由酚羟基的代替区域所决定的。在2种黄酮提取物中以红莓叶的黄酮类化合物除去游离基的效果最好，且在一定浓度范围内呈线性关系。

3 结论

红莓叶中黄酮类化合物含量高，具有良好的抗氧化活性，是一种很好的非人工抗氧化活性物质，可作为部分保健食品和化妆品的有效成分之一。该研究结果对促进红莓叶资源的开发与利用具有一定的参考价值。