纳豆发酵原料筛选及其功能产品的开发

龙继艳，戴明，钟瑶，李梦鑫，蒋咏梅

（福建师范大学 生命科学学院，福建福州 350007）

纳豆风味独特，是以大豆为原料经蒸煮后接入枯草芽孢杆菌发酵而成的传统食品，至今已有上千年的历史。1987年，Sumi等人[1]首次从纳豆中提取到纳豆激酶，并对其进行系统研究，发现其属于丝氨酸蛋白酶，具有显著的溶栓活性，可切开血栓上的纤维蛋白凝块。除此之外，纳豆激酶还可以诱导纤溶酶原激活剂的产生，从而激活自身的纤溶系统[2]。纳豆激酶安全无毒，在人体内温度和pH条件下，性能稳定，半衰期长，能够温和持续地预防血栓的形成。除含有纳豆激酶外，纳豆中的糖肽活性物质、胰蛋白酶抑制剂、异黄酮和多胺等抗癌物质的含量也远高于原料大豆，食用纳豆及相关产品不仅可以防治心血管疾病，还有助于人体健康。

20世纪90年代以来，纳豆的发酵工艺已成为研究热点，除对传统的大豆固体发酵纳豆工艺进行优化之外，人们尝试了豆粕、豆渣等多种原料[3]，并通过液体发酵方式提高纳豆激酶的产量[4]，均取得一定进展。尽管纳豆的保健功能已为众人熟知，但纳豆相关产品在我国市场占有率很低，其原因是在纳豆发酵过程中，大豆蛋白质降解为氨基酸时产生一种特殊的氨臭味。因此，降低纳豆中氨臭味成为其市场化的关键所在。本实验选择黄豆、绿豆和红豆作为原料发酵纳豆，综合感官评价、酶活测定和体外溶栓实验结果，选择最适原料进行纳豆产品的研制，以期为纳豆食品的开发提供有益的参考。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

1.1.1 原料

纳豆芽孢杆菌，本实验室分离保藏。

1.1.2 仪器与试剂

HWS-250恒温恒湿培养箱，宁波新艺超声仪器设备有限公司；HWS24电热恒温水浴锅，上海一恒科技有限公司；GI54DWS高压蒸汽灭菌锅，厦门精艺兴业科技有限公司；TG16-WSD台式高速离心机，湖南湘仪仪器有限公司；SW-CJ-2D净化工作台，苏州智净净化设备有限公司。

牛纤维蛋白原、牛凝血酶，上海源叶生物科技有限公司；尿激酶，中国食品药品检定研究院。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种活化及种子液制备

斜面保藏菌株接入30 mL液体种子培养基，37 ℃、180 r/min恒温振荡培养24 h。

1.2.2 纳豆发酵工艺

分别选取黄豆、绿豆和红豆，清洗浸泡16 h使之充分吸水膨胀，沥水后于121 ℃灭菌20 min，冷却至50 ℃左右，2 %接种量接入种子液，30 ℃恒温培养24 h，置4 ℃冰箱后熟。

1.2.3 酶液制备

取适量纳豆样品于烧杯中，加入5倍体积NaCl溶液（0.9%），搅拌2 h，4 ℃下10 000 r/min离心5 min，取上清液备用。

1.2.4 纳豆激酶活性测定

采用纤维蛋白平板法[5]。以不同浓度尿激酶标准品（100 U/mL、200 U/mL、300 U/mL、400 U/mL、500 U/mL）各10 μL点样于纤维蛋白平板，以溶解圈面积为横坐标，酶活力为纵坐标作图，绘制标准曲线。以待测粗酶液代替尿激酶标准品，其余条件同上，测量溶解圈的直径，根据标准曲线计算纳豆激酶活力。

1.2.5 纳豆激酶体外溶栓实验

稀释待测酶液至10倍、50倍、200倍和1 000倍，取原液和各个稀释液6 mL置于50 mL洁净干燥离心管中，以pH为7.2的磷酸缓冲液为空白对照。取自然凝固新鲜鸡血，分割为1.5 g左右小血块，分别称重（W1）后加入上述离心管，37 ℃恒温水浴，分别于0 h、4 h、8 h、12 h和16 h取出血块后称重（W2），根据公式（1）计算溶解率。

1.2.6 纳豆糕的研制

纳豆碾碎，加入一半重量的炒熟面粉及适量白砂糖，揉捏混合均匀，装入模具，制成成品。

从气味、口感、色泽、外型、内部组织5个最为直观的角度，设计纳豆糕感官评定标准如表1所示。

2 结果与分析

2.1 不同原料对纳豆发酵的影响

黄豆、绿豆和红豆分别经清洗浸泡、高压蒸煮后，进行纳豆发酵。感官特征如表2所示，黄豆纳豆的豆粒完整、口感绵软；红豆纳豆的豆粒完整度低、硬度较大，口感较差；绿豆纳豆虽完整性较弱，但口感绵软。不同种类豆粒的内部结构存在差异，因此需要的浸泡时间和蒸煮条件也不相同[6]。根据纳豆的菌膜厚度和拉丝长度可初步判断发酵过程中纳豆菌的生长情况。由表2可见，黄豆纳豆的菌膜最厚，粘液多，拉丝长约28 cm，说明纳豆菌生长良好。相比黄豆，绿豆表面的菌膜较薄，拉丝较短，约15 cm。3种纳豆中，红豆的发酵度最低。黄豆纳豆虽发酵完全、口感绵软，但氨味也十分明显，比较而言，绿豆和红豆的氨味均较低，属于可以接受的范围。

表1 纳豆糕感官评定标准

表2 纳豆感官特征

2.2 纳豆激酶活力测定结果

如图1所示，溶解圈面积与纳豆激酶活性呈线性正相关，标准曲线方程为Y=4.692 64X-463.707 4，R2=0.996 09。

图1 尿激酶纤溶性拟合曲线

利用纤维蛋白平板法检测3种纳豆的激酶活性。根据平板上透明圈半径，通过图1的标准曲线计算纳豆激酶的活性，结果如图2所示。3种纳豆中，黄豆纳豆酶活最高，达5 131.65 U/g，绿豆纳豆的酶活2 338.02 U/g，红豆仅139.38 U/g。与目前市售纳豆[7]相比，本实验中黄豆纳豆的激酶活性较高，绿豆纳豆的酶活性适中，红豆纳豆则明显低于市售纳豆。

2.3 纳豆激酶体外溶栓结果

图2 3种纳豆激酶活性

如图3所示，3种纳豆激酶中，溶栓效果最好的是黄豆；3种纳豆在18 h内对血凝块的溶解效率分别为55.8%、37.0%和24.4%，黄豆和绿豆纳豆激酶溶栓速率较快，8 h内即可完成，红豆纳豆激酶不仅溶栓效果弱，速度也相对较慢。该结果与3种纳豆的激酶活性相对应：随着酶液稀释倍数的增加，血块的溶解效率显著减弱，可见不同剂量的纳豆激酶对血凝块的溶解率有明显影响。

2.4 纳豆糕的研制

由上述结果可见，黄豆纳豆的酶活最高，体外溶栓效果最好，但却有浓重的令人难以接受的氨味。而红豆纳豆的酶活力和体外溶栓效果均较低，保健价值不高。相比较而言，绿豆纳豆不仅有较高的纳豆激酶活性和良好的体外溶栓效果，且氨味较淡，具有良好的开发前景。因此，以绿豆纳豆为原料进行了绿豆糕的研制，并随机挑选15位感官评测员，根据表1进行品鉴打分，成品和评分结果见图4。

图3 纳豆激酶对血凝块的溶解效果

图4 纳豆糕成品及评价

由图4A可见，绿豆纳豆糕外型美观、纹路清晰、颜色偏黄、外形完整。由图4B可见，纳豆糕的总体食用性还有待提高。单项指标中，气味与色泽得分最低，均为8.3分。可见绿豆纳豆虽优于黄豆纳豆，但其氨味仍不容忽视，后期可从改进纳豆发酵工艺或调整纳豆糕配比两方面入手进行优化。口感、外形、内部组织得分较高。口感指标中，大多数评测员选择“略粘牙”，说明纳豆糕的咀嚼感需要改进，可通过添加少许油脂改善口感，若添加过多，反而会引发“三高”症状，与纳豆糕的保健功能背道而驰。外形评分和内部组织评分较高，部分评测员打分较低的原因是吃到细小的白砂糖颗粒，后续可采用绵白糖替代白砂糖。

本实验纳豆糕是由绿豆纳豆、熟面粉和白砂糖3种成分组成，未添加油脂和其他成分，因此在感官评测方面有少许欠缺，后续可针对性增添其他成分，以达到更优的口感和保健效果。

3 结论

选择黄豆、绿豆和红豆进行纳豆发酵，对3种纳豆激酶的活性和溶栓效果进行检测，发现黄豆为原料发酵纳豆的酶活最高，达5 319.30 U/g，体外溶栓效果最好。选择氨味较弱、纳豆激酶活性较高及溶栓效果较好的绿豆纳豆进行纳豆糕的研制，并对成品进行了感官评测，该结果可对纳豆相关食品的开发提供参考。