药品霉菌和酵母菌总数能力验证结果分析

王芬

摘要：目的：分析药品霉菌和酵母菌总数的能力验证的结果。方法：依据能力验证作业指导书，及《中国药典》2015年版四部通则1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法进行检测，并采用双人独立操作，多厂家培养基。结果：样品|Z|值均<1，均取得满意结果。结论：分析药品霉菌和酵母菌总数能力验证结果，吸取经验，不断提高本实验室药品霉菌和酵母菌的检测能力。

关键词：药品霉菌和酵母菌总数;能力验证

【中图分类号】 R453    【文献标识码】 A      【文章编号】2107-2306（2021）17--02

生活中霉菌无处不在，它会使食品药品保质期变短、引起食品药品霉坏变质。食用霉菌超标的食品药品，如果产生一定量的霉菌毒素，可能引起急性中毒、慢性中毒。酵母虽然本身并非有害菌，但酵母超标会引起食物药物变质，促进细菌的生长，引发各种肠道疾病，食用酵母超标的食物药物可能引起腹泻，危害身体健康。

霉菌和酵母菌总数是《中国药典》2015年版四部通则1105非无菌产品微生物限度检查的项目，是评价药品安全性的重要指标【1】，参加此项目的能力验证，从能力验证的结果评价中得出有关自身能力的结论，通过能力验证得到锻炼，积累经验，更好地开展日常检验检测工作。

1材料和方法

1.1样品来源

样品由中国检验检疫科學研究院测试评价中心提供，样品编号为20-R062，20-M648。

1.2培养及试剂

沙氏葡萄糖琼脂SDA对照培养基购自中检院，沙氏葡萄糖琼脂SDA（含氯霉素）购自北京三药，沙氏葡萄糖琼脂SDA购自广东环凯和北京三药。

1.3实验方法

1.3.1样品处理：按作业指导书要求对样品进行水化溶解处理，稀释10-1到10-2两个稀释度，  依据《中国药典》2015年版四部通则1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法，进行后续检验，23.0℃，培养5天。

1.3.2具体步骤：每个项目由2名实验员独立完成（样品水化除外）：人员1和人员2，选择三个厂家培养基，环凯，三药，中检院，还增加三药的含氯霉素的SDA。

2结果与分析

2.1不同厂家的SDA，检验人员1和检验人员2的检验结果偏差不大，|Z|都小于1，与理论值比较接近。

2.2用日常药品微生物限度检验的思维，考虑样品微生物限度的限值，未考虑到能力验证样品是人工污染样品，样品菌量不一定在微生物限值内，有可能更高，本次实验只做10-1到10-2，存在取不到最适稀释级的风险。

2.3霉菌和酵母菌的检测过程要注意防止交叉污染的发生。霉菌和酵母菌数量偏低或偏高，涉及检测过程中的各个环节，如稀释度的选择、稀释过程刻度吸管的更换、倾注平板时培养基温度、加入样品并倒入培养基的时间是否控制在15min，培养基的质量控制等，需要实验室对检测过程中的各个环节加强质量控制。

2.4注意每天都观察培养结果。霉菌和酵母菌计数中霉菌48小时，已经可以看见，72小时，已经长满，如有细菌干扰，蔓延，就不好计数，所以霉菌和酵母菌应该24-48小时开始计数。并继续观察到5天。培养期间的观察时不能触碰平皿，避免孢子脱落生长，影响计数结果。

霉菌在平板上生长的菌落较大，较难辨别每个单个菌落，因此在计数时应更为仔细认真辨别。 如果霉菌酵母菌都长，酵母菌在皿底观察，更容易计数。

2.5实验关键步骤可以拍摄照片，可在实验过程中发现不满意结果时，较好的根据实际情况进行溯源分析【2】。像此次能力验证，未考虑酵母菌，直接把霉菌形态外的菌落认定为细菌，单计数霉菌菌落数，如果及时拍照，可重新计数，待后续鉴定细菌和酵母菌后，确定最终结果，避免错报。

2.6能力验证样品是人工污染样品，是定向计数，霉菌和酵母菌总数就不考虑把细菌算进去。B20200004（20-M648）样品，看菌落形态，只判断有细菌，霉菌，未对细菌进行相关鉴定，未考虑到酵母菌的可能，直接按霉菌的形态判断为霉菌，以霉菌来计数，按霉菌结果报送，存在可能漏掉酵母菌的风险。

能力验证样品发样前，应该用质控菌做相关实验，熟悉常见细菌，霉菌，酵母菌在TSA、SDA等培养基上的形态。学会鉴定区分酵母菌和细菌。酵母菌容易与细菌混淆，要做相应的实验，鉴定是酵母菌还是细菌，避免漏掉酵母菌。

2.7本次实验是检验开始后，才考虑用含氯霉素的沙氏葡萄糖琼脂，含氯霉素的沙氏葡萄糖琼脂的结果是水化样品48h后的，存在样品含菌量减少的风险。所以实验前应该提前考虑好，实验可能存在的干扰因素，参考食品检验方法，选择多种选择性培养基进行实验，比如含氯霉素SDA，玫瑰红钠、孟加拉红、PDA，或者霉菌和酵母菌测试纸片进行辅助判断。

3.细菌、霉菌和酵母菌的区别

SDA培养基中葡萄糖占62%，高糖高渗的环境对细菌有一定的抑制能力，但并不能完全抑制细菌的生长。2015年版药典微生物计数法明确了SDA培养基中细菌能够生长这一客观事实。【3】当细菌造成霉菌和酵母菌总数结果不符合规定时，明确可采用含抗生素的沙氏葡萄糖琼脂培养基或其他选择性培养基进行霉菌和酵母菌总数测定。【4】

孟加拉红培养基常用于食品的霉菌和酵母菌计数 ，其组分与沙氏葡萄糖琼脂培养基比较，除了缓冲剂、微量元素、凝固剂和供微生物生长必须的碳源、氮源及能源，其中每 1 L 还含有 0.1 g 氯霉素和 0.033 g 孟加拉红。氯霉素为广谱抗生素，可以抑制细菌的生长;孟加拉红为选择性抑菌剂，其不但可以抑制细菌生长，还能减缓霉菌因生长过快导致的菌落蔓延。而沙氏葡萄糖琼脂培养基没有选择性，细菌同样可以生长，如果大量细菌、霉菌和酵母菌同时在沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长，则无法排除细菌干扰，导致霉菌和酵母菌计数不准确。【5】

但是由于一些难以预计的因素，例如培养基的质量等。在孟加拉红培基上也可能生长出细菌菌落来，有时候未凸出琼脂表面的霉菌菌落也不太好判断。以下为一些区分孟加拉红培基上细菌、霉菌、酵母菌的方法：

3.1观察菌落特征

通常情况下三种菌落在孟加拉红培基上的特征比较：

3.2低倍镜观察菌落边缘形态：

若是肉眼观察菌落形态还无法判断的话可以用普通光学显微镜观察菌落的边缘较薄较透光的部分。观察是否具有可以辨别的特征性结构。

3.3染色法

挑取菌落用亚甲基蓝或革兰氏染色，酵母菌或霉菌在低倍镜下即可见到孢子或菌丝，而细菌不可见。

4.结论：药品霉菌和酵母菌总数测定，除了考虑定量检测的关键因素，如稀释度的选择、稀释过程刻度吸管的更换、倾注平板时培养基温度、加入样品并倒入培养基的时间控制在15min，培养基的质量控制等，还要注意区分细菌和酵母菌，鉴定酵母菌，整体提高霉菌和酵母菌的检测能力。

参考文献：

[1]吕婷婷，吴娇娇 板蓝根颗粒霉菌和酵母菌总数不确定度评定  中国药物评价 2019年第 36卷第 4期 278-280

[2]徐静姿 浙江省检测实验室阪崎杆菌和金黄色葡萄球菌检测能力验证情况分析 中国卫生检验杂志 2015年6月第25卷第12期 2052-2053

[3]国家药典委员会 中国药典分析检测技术指南  2017年7月第1版编著569

[4]国家药典委员会 中华人民共和国药典 2015 年版.四部[S].2015：144

[5]石琳，杜蓉，李学兴 药品霉菌和酵母菌计数替代培养基验证 药物分析杂志2019，39（5）  859-863