三株非小细胞肺癌细胞中MiR-21与顺铂耐药的研究

杨 秦

邵阳学院 湖南 邵阳 422000

背景介绍

肺癌是最常见的诊断癌症和全球癌症死亡的最常见原因,占2012年估计有180万新发病例和160万例死亡。大约85%的肺癌被归类为非小细胞肺癌。根据监测、流行病学和癌症统计综述，非小细胞肺癌的5年生存率低至23.6%，因为只有19%的病例在局部分期被诊断，而该疾病是高度可治愈的，5年生存率为59.5%(1)。

miRNAs是内源性的18-24个核苷酸的非编码小rna，在转录后基因表达中起重要的调节作用。这些小rna与细胞周期、凋亡、增殖、分化、代谢途径和细胞对各种应激的反应有关。据估计，miRNAs调节30%至60%的人类基因。当前癌症研究面临的最重要的问题之一是对化疗、放疗和靶向治疗的耐药性。最近的研究表明，miRNAs可以作为多种癌症的潜在预警生物标记物。miR-21水平可以从相反的方向改变药物对细胞毒性作用的敏感性，这表明存在不同的机制来决定癌细胞的毒性。多项研究表明，miRNAs可以控制肿瘤治疗的反应。在许多类型的癌症中，人们已经研究了miR-21表达与治疗反应的相关性。在乳腺癌中，miR-21过表达介导耐药性。在曲妥珠单抗白血病中，miR-21在抗柔红霉素白血病细胞系中表达上调。胃癌中，miR-21过表达诱导对顺铂(DDP)的耐药。更在乳腺癌中，miR-21过表达介导耐药性。非小细胞肺癌患者血浆中miR-21过表达被发现是吉非替尼反应的独立预测因子(2)。

本实验通过比对MRC5，顺铂敏感A549以及顺铂耐药A549细胞中miR-21的相对表达，为更深的了解miR-21和非小细胞肺癌顺铂耐药提供理论基础。

实验材料与方法

主要材料：本实验所得的细胞都来自中科院上海细胞资源库；培养顺铂敏感A549细胞和顺铂耐药A540/DDP细胞的血清来自于BI公司；细胞裂解液，RNA inhibitor来自赛末飞公司；引物由上海生工公司合成；逆转录试剂盒，q-PCR所需sybergreen来自EB公司；顺铂药物来自欣诺。

细胞培养：MRC5，顺铂敏感A549以及顺铂耐药A549细胞均在将普通贴壁细胞条件下培养(顺铂耐药A549细胞的培养需同时添加顺铂药物)。

反转录和Q-PCR实验：均采用常见方法。

结果

图 1.miR-21在三种肺细胞系中的相对表达。相对于肺正常细胞系mrc5，非小细胞肺癌细胞系A549和A549/DDP中的miR-21都出现显著上升。

细胞系miR-21相对表达量第一次实验第二次实验第三次实验平均值p值是否小于0.05与MRC5比与A549比MRC51111A5491.9231.7821.8021.836是A549/DDP2.5222.4862.3902.466是是

讨论

关于原发肿瘤的miRNA表达，有报道称，与miR-21表达较高的肿瘤患者相比，低表达miR-21的非小细胞肺癌患者似乎从辅助铂基化疗中获益良多。在放疗耐药方面，miR-21上调可抑制非小细胞肺癌细胞对辐照的敏感性，而miR-21下调可显著提高非小细胞肺癌细胞对辐照的敏感性。miR-21过表达对A549细胞凋亡的影响通过激活PI3K/Akt信号通路而增强。必须指出的是，根据最近的发现，外泌体似乎也参与了肺癌治疗的耐药性。A549细胞暴露于DDP会导致细胞比正常情况下释放更多的外泌体，而这些外泌体与其他A549细胞的相互作用会增加A549细胞对DDP的抗性。当暴露于DDP后，A549细胞受到刺激，外泌体和癌细胞中miR-21的表达水平显著升高[2]。

基于miRNA的治疗可能是一种非常聪明的癌症靶向治疗方法，因为一个负责特定功能或机制的miRNA可以同时靶向几个下游基因。miR-21过表达参与肺癌等恶性肿瘤的许多致癌途径。本次实验的结果同样说明miR-21在非小细胞肺癌细胞系中起到促进顺铂药物的耐受。开发一种抑制miR-21的靶向治疗似乎很有希望。但也存在一些局限性，如如何在细胞内达到足够的剂量才能有效抑制miRNA，以及miR-21的合适剂量。然而，到目前为止，大部分研究都是在体外进行的，仍需要进行基于anti-miR-21系统或局部靶向传递的体内研究。由于miR-21在大多数人类肿瘤中过表达，anti-miR-21的治疗传递可能仍然对大量无法治愈的癌症有益。然而，毫无疑问，还有大量的工作要做，有必要等待临床试验的药代动力学结果，以评估这些分子的安全性和效率。