稳定性微酸次氯酸消毒液发生器的消毒效果研究

王晨杰，薛源，张鑫，于萍，罗运柏

(1.武汉大学 化学与分子科学学院 有机硅化合物与材料教育部工程研究中心，湖北 武汉 430072；2.解放军第960医院,山东 济南 250031；3.中天恒安(北京)科技有限公司，北京 100000)

次氯酸钠是一种能以任意比例与水互溶的含氯消毒剂，溶于水中可生成新生态氧和次氯酸，HClO的强氧化性是NaClO溶液能够高效杀菌的主要因素[1-2]。研究表明，HClO的浓度与溶液的pH值密切相关[3-4]，当pH值在5～7的范围内时，HClO的含量达90%以上[5-7]。一般稀释后的次氯酸钠溶液呈碱性，溶液中杀菌能力较弱的ClO-离子的含量占大多数，而HClO的杀菌能力大约是ClO-离子的80倍[8-9]。因此将NaClO溶液的pH调至微酸性，HClO的浓度会极大地增加，溶液的杀菌能力显著增强。

本文设计了一台小型稳定性次氯酸消毒液发生器，通过调整成分含量和添加稳定剂，生产出具有稳定性的微酸性HClO溶液，并对该消毒液发生器的消毒效果、稳定性效果以及灭菌机理进行了研究。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

白色念珠菌(CICC 31284)、金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)、大肠杆菌(CICC 10899)均由中国工业微生物菌种保藏中心提供，菌种代数均为第三代；营养肉汤培养基和营养琼脂培养基均为人工配制；胰蛋白胨、氯化钠、次氯酸钠、稀盐酸、牛血清白蛋白、硅酸钠、碳酸氢钠、无水磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、多聚甲醛、乙醇、乙酸异戊酯、硫代硫酸钠、吐温-80、重铬酸钾、碘化钾、可溶性淀粉、浓硫酸均为分析纯。

BCN-1360型生物操作台；KF63-DHP9162B电热恒温培养箱；DZ11-2恒温水浴锅；AE224电子天平；BV01-90-2恒温磁力搅拌器；BXM-30高压灭菌锅；GT10-2离心机；Merlin Compact SEM扫描电子显微镜。

1.2 菌悬液制备

将白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌增菌培养后在营养琼脂斜面接种其中的典型菌落，在37 ℃恒温条件下培养24 h。用胰蛋白胨生理盐水溶液(TPS)轻轻洗涤营养琼脂斜面培养物，并稀释成细菌悬浮液。实验时，将有机干扰物(30 g/L牛血清白蛋白溶液)加入其中，作等半稀释，以制备实验所需的细菌悬浮液。

1.3 微酸性次氯酸消毒液的制备

稳定性次氯酸消毒液发生器结构见图1。

图1 稳定性次氯酸消毒液发生器示意图Fig.1 Schematic diagram of stable hypochlorous acid disinfectant generator1.装置本体；2.消毒液生成器主柜；3.消毒液生成器副柜；4.酸化水混合罐；5.pH电极与射流器；6.NaClO原液罐；7.自来水导管；8.盐酸稀释液罐；9.消毒液储存罐；10.出液导管；11.主柜内舱；12.稳定剂添加罐；13.射流器

组装完成后即可生产出稳定性次氯酸消毒液进行消毒实验，也可以与其他水处理单元串接使用。采用有效氯含量为60 g/L的NaClO溶液和质量分数为2%的盐酸作为主要原料，生产出稳定的微酸性HClO消毒液需要经过3道工序：第1道工序为接通自来水，分别将NaClO溶液和盐酸溶液进行稀释，并经过充分混匀后，进入第2道工序；第2道工序将已经充分稀释的两种溶液进行搅拌混合，使两者之间充分发生反应后进入第3道工序；第3道工序在混合液中加入稳定剂再次充分混合，即可产出有效氯含量为40～600 mg/L的稳定微酸性次氯酸消毒液。另外，在发生器中独立设置了在线pH电极和稳定剂添加罐，通过pH电极的检测防止酸添加过量导致氯气的产生，提高该生产工艺的安全性。

有效氯含量测定根据《消毒技术规范》[10]中规定的碘量法分别在不同反应条件下取样进行。发生器工艺流程见图2。

图2 稳定性次氯酸消毒液发生器工艺流程图Fig.2 Process flow chart of stable hypochlorousacid disinfectant generator

1.4 实验方法

1.4.1 中和剂鉴定实验 以金黄色葡萄球菌、白色念珠菌作为实验菌，按照中和剂悬液定量鉴定程序，设定6组平行实验。作为实验结果，当第1组无细菌生长或细菌数远小于第2组，第2组中的菌落数超过5 cfu/mL，第3，4，5组内的菌落数相对误差率≤15%，第6组没有细菌生长时，实验重复3次，统计平均值，若结果一致，表示所用中和剂符合实验要求。

1.4.2 悬液定量杀菌实验 将由发生器产出的消毒液于20 ℃恒温5 min，取无菌试管向其中加入0.5 mL细菌悬浮液，再加入0.5 mL浓度为30 g/L的牛血清白蛋白溶液和4.0 mL消毒液(使用TPS作为阳性对照)，充分混匀。在反应至达到设定时间后，取0.5 mL上述混合物加入到含有4.5 mL中和剂的试管中，混合10 min后，适当稀释接种并在37 ℃恒温条件下培养。计算消毒液的杀灭对数值，实验重复3次，取其平均值。

1.4.3 消毒液稳定性实验 选择硅酸钠和碳酸氢钠作为稳定剂，将不同含量的稳定剂加入到发生器直接产出的消毒液中进行实验。分别称取5 g上述两种稳定剂于250 mL烧杯中，搅拌，使其完全溶解，移入500 mL容量瓶中，稀释至刻度。取5个250 mL磨口玻璃瓶，分别加入200 mL 发生器产出的消毒液，设定5组平行实验，固定硅酸钠的量,改变碳酸氢钠的含量。另外设置空白实验组,不添加任何稳定剂。用碘量法测定在80 ℃条件下放置6 h后的有效氯的含量,选择使有效氯含量降低最少的稳定剂组合，每组实验重复3次，取其平均值。

1.4.4 消毒液对细菌表面形态的损伤 将有效氯含量为80 mg/L的消毒液处理之前和之后的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌细胞悬液在4 ℃下以3 000 r/min离心10 min，然后用1 mL PBS洗涤2次，弃去上清液。 将以上样品在0.1 mol/L PBS的4%多聚甲醛溶液中重悬，并保持6 h。细菌细胞用30%，50%，70%，80%，90%和100%乙醇溶液连续脱水，并在每种溶液中处理15 min。脱水后，将样品浸入乙酸异戊酯/乙醇(1∶1，V/V)中5 min，然后浸入100%乙酸异戊酯中5 min。最后，将细胞在室温下干燥。通过使用双面胶带将电池连接到大型SEM管上，涂上金钯，使用扫描电镜进行观察。

2 结果与讨论

2.1 中和剂实验结果

实验结果见表1。

表1 中和剂鉴定结果Table 1 Neutralizer identification results

由表1可知，采用5 g/L Na2S2O3+ 5 g/L吐温-80的0.03 mol/L PBS溶液可以有效地中和250 mg/L有效氯的消毒液对实验菌的后续杀菌作用，该中和剂以及作用后的反应物对实验菌和培养基无不利影响。

2.2 发生器产出消毒液定量灭菌实验

实验结果见表2。

表2 发生器产出的消毒液对细菌的杀灭效果Table 2 Germicidal efficacy of disinfectant produced by generator on bacteria

由表2可知，用该发生器产出150 mg/L有效氯的产品作用5 min，金黄色葡萄球菌的杀灭对数值为5.26，大肠杆菌为5.78，白色念珠菌为4.21。

2.3 消毒液稳定性实验

向发生器产出的消毒液中添加Na2SiO3和Na2-CO3，在80 ℃条件下放置6 h的稳定效果见表3。

表3 加入稳定剂Na2SiO3与Na2CO3的稳定效果Table 3 Stabilizing effect of adding stabilizers Na2SiO3 and Na2CO3

由表3可知，不加入任何稳定剂的空白对照组，有效氯含量下降了31.26%；加入15 mL Na2SiO3和20 mL Na2CO3的消毒液，有效氯含量下降仅为5.24%，极大地提高了消毒液的稳定性，延长其贮存时间，使其适用性更为广泛。在200 g消毒液中加入0.3 g Na2SiO3和0.4 g Na2CO3作为复配稳定剂，可以有效地延长产出消毒液储存时长。Na2SiO3和Na2CO3的加入可以使消毒液增粘、增稠，减少溶液分子间的碰撞，降低了消毒液在储存时的活性，其中Na2CO3的加入还可以抑制反应器中由于酸性过高而产生的氯气。

2.4 次氯酸消毒液对细菌表面形态的损伤

经过有效氯含量为80 mg/L的次氯酸消毒液处理5 min之后，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌表面超微结构的变化结果见图3。

图3 细菌表面超微结构观察图Fig.3 Ultrastructure of bacterial surfaceA.未经处理的大肠杆菌；B.次氯酸消毒液处理的大肠杆菌；C.未经处理的金黄色葡萄球菌；D.次氯酸消毒液处理的金黄色葡萄球菌

由图3可知，未经处理的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌细胞表现出完整且具有规则的形态(图A，C)，经过次氯酸消毒液处理后，两种细菌表面均出现明显地收缩，部分细胞壁塌陷(图B，D)。细胞表面不可逆转的破坏可能是氯化过程中微生物失活的主要步骤，次氯酸消毒剂会破坏细菌的表面结构，在消毒过程中，位于细胞壁上的肽聚糖的N末端氨基酸可能被氧化，从而导致细菌形态发生变化[11]。综上所述，次氯酸消毒剂确实通过引起严重的形态学损伤而氧化或灭活细菌细胞。

3 结论

设计的新型次氯酸发生器产出的消毒液具有良好地消毒效果。当产出消毒液有效氯含量为150 mg/L时，分别作用于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌5 min，前两者杀灭对数值>5.00，后者杀灭对数值>4.00，对细菌繁殖体具有良好的杀灭作用。该新型次氯酸发生器装置另外安装稳定剂添加罐，每200 g消毒液中加入0.3 g Na2SiO3和0.4 g Na2CO3作为复配稳定剂，使得产出消毒液的稳定性极大地提升，可以有效地延长产出消毒液储存时长。消毒液作用于细菌后对细菌表面形貌造成严重损伤，细菌表面出现明显的裂解与破损，从而起到消毒灭菌的作用。

该新型次氯酸发生器可以连续生产出微酸性的次氯酸消毒液，在装置中设置了在线pH电极来控制原料液的添加量防止产生氯气，产出的消毒液具有稳定性强、杀菌能力强、安全无腐蚀等优点，适用于共公共卫生环境、食品加工、水处理等场景。