甲型肝炎灭活疫苗（MRC-5 细胞）中乙二胺四乙酸二钠残留量HPLC 检测方法的建立及验证

樊雪，王一平，李璇，修雪亮，廖辉，周荔葆

辽宁成大生物股份有限公司研发部，辽宁沈阳110179

甲型肝炎（hepatitis A，HA）灭活疫苗（MRC-5 细胞）系将甲型肝炎病毒接种至人二倍体细胞中，经培养、收获、病毒纯化及灭活后，加入铝佐剂制成，用于预防甲型肝炎［1］。在HA 灭活疫苗生产工艺中，需加入乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）对细胞进行消化，后续工艺中可能有部分残留。EDTA-2Na 易与钙螯合，长期大剂量服用或静脉输注速度过快可引起低钙血症。研究表明，肾损伤、结核病及心脏功能损伤患者应慎用［2］。EDTA-2Na 与 FeCl3在酸性条件下发生络合反应，生成具有紫外吸收的稳定的络合物，因此可采用HPLC 法进行测定。目前，国内外HPLC 法检测EDTA-2Na 残留量主要应用于化学药品和食品领域［3-6］，疫苗中EDTA-2Na 残留量检测的参考文献较少。

本文建立了检测HA 灭活疫苗（MRC-5 细胞）中EDTA-2Na 残留量的HPLC 法，并对方法进行验证。

1 材料与方法

1.1 供试品及对照品 3 批HA 灭活疫苗原液供试品（批号：HAV20170202-原、HAV20170301-原及HAV20170302-原）由辽宁成大生物股份有限公司生产；EDTA-2Na 对照品（批号：K1424041）购自美国阿拉丁公司。

1.2 主要试剂及仪器 乙腈（批号：137696）及磷酸（批号：158625）购自美国Fisher 公司；磷酸二氢铵（批号：C10079253）购自上海 Macklin 公司；40%四丁基氢氧化铵（批号：A1703020）购自美国阿拉丁公司；FeCl3（批号：STBG6072）购自美国Sigma 公司；LC-2010A 型高效液相色谱仪购自日本SHIMADZU 公司；C18 色谱柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）分别购自美国Thermo 公司和Waters 公司；所有试剂均为色谱纯。

1.3 色谱条件及优化 采用反相色谱柱。流动相为水相-有机相，水相为四丁基氢氧化铵的磷酸盐溶液（离子对试剂）［7-8］，用磷酸调 pH，经 0.22 μm 滤膜过滤，超声，有机相为乙腈；……