外泌体的生物学功能和调控机制研究进展

彭梦阳 ，贺 花，王献伟，蔡翠翠，刘 贤，徐泽君，茹宝瑞，雷初朝，陈 宏，黄永震*

（1.西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌 712100；2.西北农林科技大学动物医学学院，陕西杨凌 712100；3.河南省畜牧总站，河南郑州 450008；4.宁夏农林科学院固原分院，宁夏固原 756000）

1983 年，Pan 等[1]发现羊未成熟红细胞可以分泌囊泡结构。1987 年，Johnstone 等[2]将这种在绵羊红细胞上清液中发现的直径为30～100 nm、密度在1.10～1.20 g/mL的膜性小囊命名外泌体（Exosomes）。随后发现多种细胞可以分泌外泌体，且在体液中也可以检测到，但当时对其研究不透彻，人们一度认为其为细胞代谢废物。1996 年，Stoorvogel 等[3]发现外泌体具有改变细胞外微环境、参与免疫调节以及影响机体健康等重要功能，外泌体才开始得到广泛关注。2007 年，Valadi 等[4]发现外泌体中含有mRNAs 和miRNAs。随着研究不断深入，研究者们发现外泌体的更多组分，更加深刻认识到外泌体在参与细胞间物质运输与信息传递方面以及在生物生理与病理中发挥重要作用。

外泌体来源广泛，功能多样，几乎所有细胞都可分泌外泌体，而这些外泌体具有源细胞的种种特点，其内含蛋白质、核酸和脂质。目前外泌体在疾病诊疗方面的研究取得了多项成果，展示了外泌体参与机体免疫应答、细胞迁移、细胞增殖分化、细胞凋亡、肿瘤侵袭等过程。外泌体在畜牧兽医领域研究较少，且仅集中于乳液外泌体中的miRNA。研究外泌体有助于认识细胞间广泛的联系与互作关系，有助于认识机体组织增殖分化与肿瘤转移机制，可用于疾病诊断与治疗。本文主要对外泌体的发生、分离纯化及功能调控机制进行综述，为选择合适的外泌体提取方法与更深入研究外泌体提供参考。

1 外泌体发生机制与生物学特性

外泌体属于细胞外囊泡的一个亚组，主要由细胞通过胞吞作用形成核内体，而后核内体以内出芽的方式形成管腔状囊泡，在这个过程中囊泡会有目的地分拣脂质、蛋白质与核酸成分，形成有亚细胞结构的多囊体，其通过Ca2+依赖途径与细胞膜融合将其内小囊泡释放出来[5]，这些小囊泡就被称为外泌体。外泌体的形态大小变异较大且范围不同的原因是大多研究不要求囊泡浓度，外泌体往往是各种囊泡的混合物[6]。由于外泌体的分泌受多种分子调节，Ras 超家族中Rab 蛋白是备受关注的一类，其成员Rab27a 主要通过修饰基因调节外泌体的分泌与作用，研究证明Rab27a 过表达癌细胞外泌体可以引起更有效的抗肿瘤免疫效应[7]，后来的研究验证了利用外泌体治疗肿瘤思路的可行性[8-9]。

外泌体膜厚度约5 nm，形态为圆形或椭圆形“杯状”囊泡[10]，外泌体中存在的蛋白与核酸种类多样，且与源细胞组分与功能相联系。截止2016 年，外泌体中被发现的蛋白质有9 769 种，mRNA 有3 408 种，miRNAs 有2 838 种 （http://www.exocarta.org/）。在口腔来源的外泌体研究中，研究者曾分离腮腺唾液外泌体中491 种蛋白质，其中265 种与腮腺导管中蛋白一致，有72 种与其他尿液蛋白质一致[11]。可见不同外泌体有共同的保守成分，广泛存在的外泌体大多均包括CD9、CD63、CD81、MHC、Alix、flotillin、TSG101、HSC70 等多种标志蛋白，可以用来鉴定和分选外泌体[12]。

2 外泌体的分离与纯化

外泌体在疾病早期诊断与靶向治疗方面的作用越趋重要，但其分离纯化方法尚无统一标准。目前外泌体的提取方法较多，提取产物在含量、纯度、活性方面存在不同，各有优缺点。其提取分离原理：根据外泌体与其他物质沉降系数不同进行离心分离；根据外泌体大小进行过滤分离；根据外泌体大小及理化性质沉淀分离与识别外泌体表面特异蛋白并进行分离。外泌体具体分离方法及优缺点见表1[13-26]。

3 外泌体的生物学功能与其调控机制

外泌体来源分布广泛且功能多样，与各自源细胞关系密切，不同外泌体具有不同生物学特点，受其内容物、组织微环境、受体细胞等因素影响会产生不同的作用效果[27]。近年来研究发现，骨骼肌外泌体在肌肉生成与再生、肌肉萎缩等过程中起到不可忽视的作用[28]；癌细胞外泌体具有参与肿瘤转移、促进或抑制肿瘤进展、引起机体免疫应答、促血管生成作用[29]。骨细胞外泌体有骨重塑、骨代谢、成骨细胞破骨细胞分化等功能[30]；杆菌来源外泌体有抑制宿主免疫、灭杀其他细菌、释放毒力因子、促进自身增殖生长、引起宿主免疫应答等功能[31]；胎盘外泌体膜上含有胎盘组织的凋亡信号分子，在母体对胎儿的免疫耐受作用中发挥免疫作用，除此之外还有参与螺旋动脉重铸与胎盘屏障形成的功能[32]；间充质干细胞外泌体种类多样功能众多，有免疫调节功能、促血管新生、信息传递调控分化、组织修复与细胞增殖等功能[33-34]；脂肪组织外泌体具有相同的功能，同时，成熟的脂肪细胞外泌体与脂肪干细胞外泌体有更强的成脂分化能力[35]。

外泌体发挥作用的方式主要有3 种[36]：第一种是外泌体膜上配体与靶细胞膜上受体结合传递细胞间信息发挥作用；第二种是外泌体与靶细胞融合释放其内含的各种促因子与核酸实现信息转运发挥功能；第三种是外泌体释放胞内物质作用于靶细胞表面受体，完成信息传递产生生物学效应。

3.1 外泌体的免疫调节功能与调控机制 免疫调节功能的调控机制主要有外泌体直接作用于靶细胞启动下游信号和外泌体miRNA 介导调控2 种。胎盘外泌体表面存在胎盘组织表达的Fas 配体（Fas Ligand，FasL）与肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（Tumor Necrosis Factor-Related Apoptosis-Inducing Ligand，TRAIL），这2 种信号分子通过与靶细胞接触触发T 细胞凋亡，从而维持正常妊娠[37]；Delorme-Axford 等[38]和Donker 等[39]研究发现，C19MCmiRNA 是胎盘外泌体miRNA 主要成分，该miRNA 可以诱发病毒自我吞噬和抑制增殖，从而提高胎儿对外界的抗感染能力；在烧伤大鼠模型中，间充质干细胞外泌体内含的miRNA-181c 可以降低TLR4（Toll 样受体）表达，从而降低NF.κB/p65 的激活，抑制过度炎症反应[40]；在小鼠糖尿模型中，间充质干细胞外泌体通过内含的siFas基因和Anti-miRNA-375沉默人胰岛相关基因，从而提高胰岛移植效果[41]。在肺结核杆菌外泌体研究中发现，外泌体表面过表达热休克蛋白70（Heat Shock Protein 70，HSP70），此现象激活核因子κB（Nuclear Factor kappa-B，NF-κB）途径诱导巨噬细胞释放肿瘤坏死因子而引起促炎反应[42]；肿瘤细胞外泌体表达的FasL 可以诱导CD8 T 凋亡，抑制Jak3 和细胞周期素D3 来阻断杀伤NK 细胞周期，从而为肿瘤生长创造条件，肿瘤细胞外泌体可以介导多种RNA 转移来促进癌症发展[43]。

表1 外泌体提取方法

3.2 外泌体调控血管新生功能及其机制 血管新生是指从现有血管形成新血管的过程[44]。外泌体可以通过microRNA 调控内皮细胞功能和血管生成，如miRNA-424 通过靶向cullin2 促进血管新生[45]；外泌体富集的miRNA-125a 可以通过靶向基因 3' 非翻译区域阻碍抑制剂表达，促进血管生成；在ips-MSC 外泌体处理的大鼠股骨头坏死模型中，血管内皮细胞（Vascular Endothelial Cells，VEC）形成血管能力增强，并且发现其PI3K/Akt 信号通路被激活[46]；经过NO 释放物处理过的外泌体可以增强促血管生成因子的生成，进而发挥作用[47]；敲除细胞外基质金属蛋白酶诱导因子（Extracellular Matrix Metalloproteinase Inducer，EMMPRIN）基因，VEC 促血管生成作用减弱，说明金属蛋白酶诱导因子在外泌体促血管生成中有重要作用[48]；在研究心肌细胞时发现，在缺氧状态，外泌体中高表达的miRNA-126 可以抑制炎性细胞因子，抑制心肌细胞凋亡，发挥免疫作用，同时其还可以促进微血管的生成和迁移，修复损伤细胞维持心脏功能[49-50]；在肿瘤细胞外泌体中，其表皮生长因子受体和miRNA-150 等生物分子可以诱导VEGF 和其受体表达，促进血管生成和肿瘤生长[51]。

3.3 外泌体在骨代谢中的作用及其机制 间充质干细胞的外泌体因内含相应的miRNA 具有促进分化的功能，在骨代谢中有重要作用，其内含的miRNA-223 可以参与破骨细胞的形成，但过度表达则起抑制作用[52]；miRNA-378 促进破骨细胞形成和分化[53]，let-7 和miRNA-140 则协同参与软骨发育[54]；何伟等[55]通过大鼠颅骨缺损动物模型验证人骨髓间充质干细胞外泌体在体内骨再生的作用，发现骨髓间充质干细胞外泌体促进骨再生的能力与上调Wnt/β-catenin 通路有关。β-catenin广泛存在于细胞质内，受到Wnt 信号激活后转入细胞核内，调节目标基因RUNX2，促进脂肪干细胞成骨分化。崔梦莹等[56]研究发现，脂肪干细胞来源外泌体可以上调β-catenin 蛋白表达，促进脂肪干细胞成骨分化。宋子珺等[57]用脂肪干细胞外泌体处理骨细胞凋亡模型，发现外泌体可以抑制低氧缺血环境下骨细胞的凋亡，提示脂肪干细胞释放的外泌体可以促进骨组织修复与再生。高坤等[58]研究发现，膝关节炎滑膜液分泌的外泌体能够通过YAP 去磷酸化抑制MMP-1、MMP-13 分泌，促进软骨细胞的增殖，具有保护关节软骨的作用。

3.4 外泌体在神经细胞中的作用及其机制 神经细胞外泌体参与疾病的发生，同时在神经生长与保护方面起作用，如小胶质细胞和星状胶质细胞外泌体含有的促炎性细胞因子和金属蛋白酶会破坏血脑屏障在脑组织引起炎症[59]；伊刚等[60]在大鼠上的研究发现，脂肪干细胞来源外泌体对周围神经损伤后再生有一定促进作用，其机制可能与减少SCs 凋亡、抑制其自噬、减轻神经瓦勒变性有关。Ebrahimkhani 等[61]研究表明，含有干扰素、肿瘤坏死因子等物质的外泌体可以破坏血脑屏障，同时释放内容物，导致血脑屏障脑内皮细胞之间的组织结构和紧密性降低，进而使白细胞迁移来，引起髓鞘脱失，造成多发性硬化。陈晨等[62]开展了间充质干细胞源性外泌体针对神经退行性疾病的研究，发现其作用机制广泛，具有免疫、再生、促进细胞增殖等众多功能，提出运用间充质干细胞源性外泌体治疗神经退行性疾病具有光明前景。

3.5 外泌体的其他功能和相关作用机制 研究表明[63-64]，终末分化细胞（如内皮细胞、成骨细胞、神经细胞等）能够分泌外泌体，促使相应的干细胞成血管内皮分化、成骨分化、成神经分化。脂肪细胞外泌体有促进脂肪干细胞分化的功能[65]。脂肪干细胞外泌体的组织修复和再生功能主要是通过传递脂肪干细胞来源或自身特异性包装的蛋白、脂质、mRNA 和miRNA 等物质，并介导旁分泌通路以及所需的营养因子和炎症因子，使损伤组织中的细胞重新进入细胞周期[66]。骨髓间充质干细胞外泌体有增加心肌收缩力的功能，可能是其内含的miRNA-21-5p 通过PI3K 信号通路起作用[67]；外泌体与病毒的生命活动有关，经过EB 病毒的诱导会使外泌体中含病毒miRNA，并传染给未受感染的受体细胞，此过程通过外泌体可以避开机体免疫监视与攻击[68]。在外泌体与病毒间的相关研究中发现，外泌体携带RNA病毒组分可促进病毒感染，病毒可能通过外泌体传递蛋白[69]、传递miRNA[70]，其中无囊膜RNA 病毒可依赖生成外泌体的ESCRT 通路，将外泌体的双层膜作为后天获得的囊膜抵御宿主抗体中和以逃逸宿主免疫[71]。

外泌体在各领域的研究火热、成果丰硕，已有不少外泌体疗法的临床试验且结果较好[72]，但在畜牧兽医领域的研究还比较少。Qu 等[73]通过对受体和供体小鼠输卵管液中的外泌体进行分离对照实验，发现供体小鼠输卵管液中的外泌体浓度显著高于受体小鼠，提示高浓度的输卵管液外泌体可提高胚胎抗凋亡和分化水平，改善移植胚胎的存活率。Du 等[74]利用猪精浆外泌体处理精子，发现外泌体可以直接结合到精子头部，抑制精子过早获能，提高精子的质膜完整性和抗氧化能力，维持精子生存能力。Sohel 等[75]分离牛卵泡液外泌体与非外泌体组分并提取分析其miRNA 组分，发现牛卵泡外泌体含有的miRNA 参与调控卵母细胞的成熟和生长。Zhu 等[76]通过重组腺病毒研究外泌体miRNA 对猪肺泡巨噬细胞的影响，发现其通过抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）蛋白的表达发挥抗病毒作用。

4 结 语

外泌体具有稳定的物质基础与广泛的分布，功能多样，作用于生物生命活动的方方面面，目前对它的研究已是生命科学中的一个重要领域。外泌体具有与靶细胞高效结合的机制，作为新型疫苗与靶向药物载体的潜力极高；它携带的丰富的生物信息物质可以使其发挥改善细胞微环境，参与到机体免疫、组织修复、器官发生与维系等功能，目前研究人员已对肝、肺、肾、心、骨、肌肉等多种组织或异变的肿瘤组织外泌体有了深入的了解；检测外泌体蛋白以及核酸成分可以用于诊断肿瘤，同时将其研究应用到实际生产中可以获得更多经济效益。如使用B 细胞外泌体进行免疫治疗、利用外泌体的抗病毒作用防控疾病、利用输卵管外泌体提高胚胎移植成功率等。虽然外泌体研究进展较快，但目前仍对其众多生物学功能作用机制及其多样的信息物质还不甚了解，外泌体用于疫苗与高效安全的修复治疗还有待观望，且目前还缺乏一个可以大量且安全高效分选纯化外泌体的方法。有关外泌体研究与应用仍需要继续深入探索，阐明外泌体的功能及其机制，并用实际生产、揭开某些生物奥秘、辅助攻克不同医学难题。