猪溶血性曼氏杆菌的分离与鉴定

刘泽文，袁芳艳，刘 威，高 婷，周丹娜，杨克礼，段正赢，郭 锐，梁 婉，田永祥

（湖北省农业科学院畜牧兽医研究所∕农业农村部畜禽细菌病防治制剂创制重点实验室，武汉 430064）

从湖北省某有肺炎症状死亡的肥育猪中分离出一种呈两极着色、革兰氏染色阴性的短小杆菌，经PCR 和生化鉴定确定为猪溶血性曼氏杆菌（Mannheimia haemolytica）。现将试验情况报告如下。

1 材料与方法

1.1 培养基

TSA 和TSB 培养基，按说明书配制，灭菌后加入5%的小牛血清。

1.2 病料采集与培养

采集发病猪肺脏，接种含5% 血清的TSA 平板，37 ℃培养20～24 h，挑选单个带蓝光菌落，再接种5% 血清的TSA 培养基，37 ℃培养20～24 h 后进行细菌鉴定。

1.3 细菌的鉴定

1.3.1 镜检 挑选TSA 培养基上的单个菌落，经革兰氏染色，显微镜观察细菌形态。

1.3.2 PCR 鉴定 用细菌通用引物16s 进行鉴定，参照文献［1］合成PCR 引物：上游引物sgF：5’-AG AGTTTGATCATGGCTCAG-3’；下游引物sgR：5’-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3’，扩增片段大小1 500 bp 左右。PCR 扩增条件：95 ℃预变性3 min，94 ℃变性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35 个循环；72 ℃延伸10 min。

1.3.3 生化试验 挑选TSA 上单个菌落接种改良TSB 培养基，37 ℃振摇培养16～20 h 后分别接种糖发酵和其他生化试验培养基小管，37 ℃培养，观察结果。

1.4 药敏试验

将分离纯化的菌株按常规方法进行药敏试验［2］。

1.5 致病性试验

将分离菌株接种TSB 培养基，37 ℃培养18 h后用于小白鼠攻毒进行细菌计数，然后进行浓缩后稀释成5×107、1×108、2×108、3×108CFU∕mL 剂量组对小白鼠进行攻毒，每组8 只小白鼠，每只腹腔注射0.5 mL，观察小白鼠的死亡情况。

2 结果与分析

2.1 形态、染色特性

分离菌株在TSA 琼脂平板上形成圆形、光滑、湿润、半透明小菌落（图1）。革兰氏染色呈两极着色、短小的阴性杆菌（图2）。

图1 分离菌……