沙林染毒小鼠乙酰胆碱酯酶活性和含量与作用时间的相互关系

李 尧，黄静宜，邢欢纯，章子男，3，王 琦，王永安，杨 军

（1.军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所，高毒物质对抗药物研究国家重点实验室，北京 100850；2.中国人民解放军32292部队，黑龙江 牡丹江 157000；3.中国人民解放军95865部队，北京 102200；4.中国人民解放军32265部队，广东 广州 510000）

沙林（sarin），全称甲氟膦酸异丙酯，属于神经性毒剂，可以通过呼吸道或皮肤黏膜侵入人体，速杀性极强，极少量沾染后数分钟之内导致人员伤亡。1939年由德国合成并正式装备部队，二战后在美国和前苏联等军事大国的化学武器库中大量贮存［1-2］，也是迄今使用最多、造成伤亡最大的神经毒剂。两伊战争、1995年日本东京地铁毒气事件以及2013年叙利亚毒气弹事件中均使用了沙林，造成大量人员伤亡［3-5］。

大量研究结果已证实，中枢及外周乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，AChE）与神经性毒剂相互作用形成膦酰化胆碱酯酶，使其失去水解乙酰胆碱（acetylcholine，ACh）的能力，造成神经递质在体内的堆积，进一步引发胆碱能系统功能亢进是神经性毒剂中毒的主要原因［6-7］。对中枢和外周AChE与沙林之间的量效关系，动物染毒后毒剂在体内随时间的变化，以及毒剂分子的实际起效剂量与总染毒剂量之间的关系鲜有报道。本研究选择KM小鼠作为研究对象，观察不同剂量沙林染毒小鼠中枢和外周AChE含量和活性随时间的变化，探讨其相互关系。

1 材料与方法

1.1 动物、药品、试剂和仪器

KM小鼠，雄性，体质量18～22 g，购自北京市维通利华实验动物技术有限公司，动物质量合格证号：SCXK（京）2016-0011。

沙林由陆军防化学院合成，纯度≥95%；硫代乙酰胆碱（acetylthiocholine，ATCH）、二硫基双硝基苯甲酸（dithiobisnitrobenzoate，DTNB）、Tris碱及Triton X-100均购自美国Sigma公司；小鼠AChE含量测定ELISA试剂盒购自江苏酶标生物科技有限公司；其他化学试剂均购自国药集团化学试剂有限公司；所有化学试剂均为分析纯。

高速低温离心机（3-18K，美国Sigma公司）；酶标仪（VERSA max，美国MD公司）；高速低温组织研磨仪（KZ-III-F，武汉塞维尔生物科技有限公司）；隔水式恒温培养箱（GHP-9080，上海一恒科技有限公司）；涡旋仪（Ql-901，海门市其林贝尔仪器制造有限公司）。

1.2 EIIman法测定小鼠脑和外周血AChE活性［8］

230只小鼠，按体质量随机分为23组，每组10只。颈部sc给予沙林100，200，250和320 μg·kg-1，染毒前记录各组体质量，染毒后不同时间点（10 min，1 h，4 h，24 h，48 h和72 h）收集血液及全脑，并记录脑重。外周血液样品按照1：100加入去离子水，涡旋混匀；脑样研磨去除所沾血液后记录研磨后的重量，加入胆碱酯酶提取液匀浆1.3 mL，离心10 min（4℃，12 000×g），上清液按照1：25加入PBS，涡旋混匀。处理后的外周血液样品和全脑样品加入96孔板，每个样品设定6复孔：前3孔加入80 μL PBS，后3孔加入50 μL PBS和30 μL ATCH（含0.086% ATCH的PBS溶液）。离心1 min（4℃，1000×g）去除孔内气泡，37℃恒温箱中孵育30 min，各孔加入20 μL DTNB（含0.03% DTNB的PBS溶液），在酶标仪415 nm测定各孔吸光度（A415nm）值，计算脑和外周血AChE活性抑制率。抑制率（%）=1-染毒组A415nm/正常对照组A415nm。

1.3 ELISA法测定小鼠脑和外周血AChE含量

收集到的外周血离心15 min（4℃，2000×g）得血清；全脑样品为1.4中经PBS稀释后的上清液。在ELISA酶标板中依次加入浓度为0，12.5，25，50，100和200 nmol·L-1的标准品50 μL，每个标准品设置3复孔，各孔加入酶标试剂100 μL，粘贴封板膜并放入37℃恒温箱中孵育60 min。弃去孔内液体，用洗涤液重复清洗5次，各孔依次加入50 μL显色剂A和50 μL显色剂B，37℃恒温箱中孵育15 min，各孔加入50 μL终止液，在酶标仪下450 nm测定各孔A450nm值。以标准孔浓度为横坐标，A450nm值为纵坐标，做标准曲线并得出回归方程。外周血清样品和全脑样品加样及检测步骤同标准品，将样品A450nm值带入回归方程，计算得AChE浓度。

1.4 小鼠脑和外周血沙林的消耗量

有研究表明，在分子层面上抑制1个酶分子仅需消耗1个毒剂分子［9］，因此，可以结合Ellman法和ELISA所得数据，计算得到不同剂量沙林在脑和外周血的理论消耗量及其占给予动物的毒剂总剂量之间的比例。具体计算公式如下：

式中，N为脑或血内与AChE结合的沙林占染毒剂量的百分比，c为ELISA所测脑或血中AChE含量（nmol·L-1），I为 Ellman 法计算的脑或血中AChE抑制率，S为小鼠脑系数，D为对应中毒程度下的沙林剂量（μg·kg-1），Mr为沙林的分子质量。式（1）中1.3为制备脑样品时加入的液体体积（mL）；式（2）中5.83和100为每100 g小鼠含5.83 mL血液的理论值。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 沙林对小鼠体质量、脑重和脑系数的影响

如图1所示，不同剂量沙林染毒后，在72 h内各组体质量（图1A）、脑重（图1B）和脑系数（图1C）与正常对照组之间均未见明显变化，提示染毒后小鼠未形成明显的脑萎缩。各组体质量均呈增长趋势，但在4 h出现一定的降低。320 μg·kg-1组小鼠在染毒10 min内全部死亡。

2.2 沙林对小鼠脑和外周血AChE活性时效和量效的作用

沙林对小鼠外周血AChE的抑制作用见图2A。从沙林抑制AChE活性的剂量-效应关系方面，在染毒72 h内，沙林200和250 μg·kg-1组抑制率在相同时间点无明显差异，250 μg·kg-1在48 h后抑制率与其他各组间无明显差异。从沙林抑制AChE活性的时间-效应关系方面，与同组10 min时的结果比较，随着染毒后时间的延长，不同剂量沙林对外周血AChE抑制率均呈现明显下降趋势，其中100 μg·kg-1组在1 h即出现明显差异（29.17%，P＜0.01），200和250 μg·kg-1组在4 h出现明显差异（P＜0.01）。

沙林对脑中AChE的抑制作用见图2B。与同组10 min比较，沙林100和200 μg·kg-1组4 h内抑制率随染毒时间延长逐渐升高，其中100 μg·kg-1组在1 h即出现统计学差异（P＜0.01），200 μg·kg-1组在4 h出现统计学差异（P＜0.05），而250 μg·kg-1组4 h内抑制率未出现明显变化。与4 h相比，各染毒组均在24 h出现明显的下降（P＜0.01），形成波谷；在48 h又出现比较明显的升高（P＜0.01），形成除4 h外的第2个波峰；随后在72 h各组均出现明显下降（P＜0.01）。此外，在致死剂量下（320 μg·kg-1），沙林对外周血AChE抑制率为98%，对脑中AChE抑制率为96%，与250 μg·kg-1组无差异。

Fig.1 Effect of sarin exposure on body mass（A），brain mass（B）and brain coefficient（C）in mice.Mice were subcutaneously injected with saline（normal control group）or sarin 100，200 and 250 μg·kg-1for 10 min，1 h，4 h，24 h，48 h or 72 h.Brain coefficient=brain mass（g）/body mass（g）×100.±s，n=10.

2.3 沙林对小鼠脑和外周血AChE含量时效和量效的作用

通过ELISA得AChE的标准曲线为c=105.99A450nm-4.3904，c为浓度（nmol·L-1），r2=0.9994。利用该标准曲线计算小鼠脑和外周血AChE含量。从表1可见，与正常对照组相比，染毒72 h内沙林100和200 μg·kg-1组外周血中AChE含量在10 min，1 h和4 h明显降低（P＜0.01）；250 μg·kg-1组在10 min和1 h明显降低（P＜0.01）。

Fig.2 Inhibition of sarin on acetyIchoIinesterase（AChE）activity in bIood（A）and brain（B）of mice.See Fig.1 for the mouse treatment.Inhibitory rate of AChE（%）=（1-A415 nmof experiment group/A415 nmof normal group）.±s，n=10.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with 10 min exposure in each sarin dose group.

从表2中可以看到，与正常对照组相比，染毒72 h内100和200 μg·kg-1组脑内AChE含量在4 h后显著降低（P＜0.01）；250 μg·kg-1组在1 h后显著降低（P＜0.01）；各组在72 h后均与正常对照组无统计学差异。

2.4 小鼠脑和外周血沙林的消耗量

对染毒后不同时间沙林的实际消耗量及其占染毒总量的比例作图，从图3可见，各组与本组10 min相比，染毒72 h内100和200 μg·kg-1组外周血及脑内沙林消耗量均在1 h后下降（P＜0.05）；250 μg·kg-1组血和脑内沙林消耗量均在24 h后下降（P＜0.01）。

从表3中可以看到，各组与本组10 min相比，染毒72 h内100和200 μg·kg-1组血内与沙林结合的AChE在1 h后明显下降（P＜0.01）；250 μg·kg-1组在24 h后明显下降（P＜0.01）。

Tab.1 Effect of sarin on AChE content in peripheraI bIood of mice

Tab.2 Effect of sarin on AChE content in brain tissue of mice

Fig.3 Percentage of sarin binding to AChE in peripheraI bIood and brain tissue of mice at different time points after exposure.See Fig.1 for the mouse treatment.Nbrain=（cbrain×1.3×Ibrain×S）/（D/Mr）×100%；Nblood=（cblood×Iblood×5.85）/（D/Mr×100）×100%.N：effective dose of sarin in brain or peripheral blood；c：the content of AChE in brain or peripheral blood determined by ELISA；I：the inhibitory rate of AChE in brain or peripheral blood detected by Ellman method；S：brain coefficient；D：the total dose of sarin；Mr：molecular mass of sarin.±s，n=10.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with 10 min exposure in respective dose group.

Tab.3 Consumption of AChE in peripheraI bIood of mice

由表4中可见，各组与本组10 min相比，染毒72 h内100 μg·kg-1组脑内与沙林结合的AChE在1 h后明显上升（P＜0.01），200和250 μg·kg-1组在24 h后明显下降（P＜0.01）。

Tab.4 Consumption of AChE in brain tissue of mice

3 讨论

AChE分子的活性中心由丝氨酸、组氨酸和谷氨酸所构成［10］。当毒剂分子进入AChE活性中心后，丝氨酸的羟基会进攻毒剂分子的磷原子形成三角双锥过度态，神经性毒剂的离去基团离去后形成磷酰化胆碱酯酶［9］。随着沙林对小鼠染毒时间的延长，磷酰化胆碱酯酶会逐渐出现脱烷基化反应，使得AChE永久地失去活性，成为“老化酶”［11-12］。不同神经性毒剂的半老化时间相差极大，如梭曼为6.3 min［13］，沙林为8.7 h［14］，VX为1.5 d［15］。与梭曼和VX相比，本研究选用的沙林老化时间较为居中。结合经典的Ellman法和ELISA检测AChE的活性和含量，探究中枢和外周AChE随时间变化受到沙林的抑制作用。

酶抑制率是反映毒剂对染毒动物影响的核心生化指标。本研究结果显示，在相同剂量染毒条件下，染毒初期（1 h）内中枢的抑制率明显低于外周血的抑制率；随着染毒时间的延长，抑制率趋于一致。可能原因为在染毒初期，毒剂分子穿透血脑屏障进入中枢较慢，因此脑内外形成了较为明显的抑制率差异；而经过长时间的循环、代谢后，血脑屏障内外达到了一个动态的平衡，抑制率趋于一致。此外，当抑制率大幅降低时，酶的含量同步恢复正常水平；而当酶抑制反复波动时，酶含量同时处于低含量状态。同时，即便在250 μg·kg-1组中，作用于外周血和脑部的毒剂消耗量也仅占毒剂总剂量的4%，表明还有大量的毒剂并未参与反应。结合上文所述，3组毒剂对中枢AChE活性的影响在48 h均出现抑制率增加，这可能与在体内某些组织形成的NA“储存库”有关，毒剂分子并非与酶结合后其余的分子在体内被降低，依然有部分在保存活性的状态下储存在体内，随着染毒时间的延长在体内经二次释放进入中枢［16］。

综上所述，通过对不同染毒剂量不同时间点内小鼠的中枢和外周AChE活性和含量的检测，初步总结为以下规律：①体质量、抑制率和AChE含量之间有一定的相关性，3个指标可以在一定程度上相互佐证，当脑AChE抑制达到高峰时，体质量均出现一定程度的下降，而此时AChE的含量也相应降低；②从AChE抑制率的数据可直观看出，虽然外周的抑制率在持续的下降，但中枢依然会在4和48 h之间形成2次抑制高峰；③从AChE的含量推算得知，沙林的理论消耗量极低，约为0.1～1 nmol·L-1之间，仅占总染毒剂量的4%，而近96%的沙林依然残留在体内，部分沙林可能依然保留活性并未降解。结合上述规律，建议在控制沙林引发的急性中毒症状后，至少48 h内多次给予相应剂量的抗神经性毒剂药物，以清除体内未与AChE结合的沙林。