基于生物酶解法的牛乳蛋白脱敏技术研究进展

张 琦，何国庆

(浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江杭州310085)

食物过敏是一个备受各国政府及公众关注的健康问题，而牛乳是联合国粮农组织(FAO)认定的八大类主要过敏食物之一［1］。牛乳蛋白过敏(cow’s milk protein allergy，CMPA)可引发过敏性鼻炎、哮喘、湿疹、腹泻、胃肠出血等症状［2］。这种过敏反应会威胁婴幼儿健康，甚至导致其死亡。据调查显示，对牛乳过敏的学龄前儿童占0.6%～2.5%，5～16岁人群占0.3%，成年人小于0.5%［3］。

目前，降低牛奶致敏性的方法主要可以分为物理法、化学法、生物酶法等。物理法主要通过去折叠、聚合、交联等方式来改变蛋白质的高级结构，但并不改变其一级结构［4］，可以在使蛋白质改性的同时又能维持乳蛋白原有的感官品质和营养成分。生物酶法是目前应用较为广泛的一种水解方式，其操作较为简单，安全性高，并且可以与物理方法相结合来增强水解效果［5］。

针对牛乳蛋白改性，酶解法一直是研究的重点。利用蛋白酶的内切和外切作用，使蛋白质降解为肽类产物和较小氨基酸分子，酶解技术按照酶解程度和酶解后产物分子量大小及分布情况可分为轻度酶解(Slight hydrolysis)、适度酶解(Moderate hydrolysis)和深度酶解(Extensive hydrolysis)。其中，轻度酶解和适度酶解通常被划归为限制性酶解，因其可实现水解度和产物多样性控制而多应用于生产功能性蛋白和活性肽。深度酶解则多用于得到低抗原性酶解产物，因其产物主要是短肽和单体氨基酸，并且90%的肽分子量都低于500 Da，经常应用于营养配方。同时，酶解分为单酶水解和复合酶水解，采用复合酶水解时根据不同酶的添加顺序又可以分为同步酶解和分步酶解［6］。

目前，虽然酶解技术逐渐完善，但体系方法相对单一，如果想将酶水解工业化应用，那么水解位点的准确控制、水解产物组成及分子量分布以及对于水解产物的标准化应用等，都是亟待解决的问题。如果可以将其与当前发现的抗原表位信息和酶的作用位点信息相结合，以进行针对性地破坏，得到理想的目标产物，对于低敏乳品的开发将具有重大意义。

本文主要对牛乳过敏蛋白致敏表位、几种生物酶水解技术及其作用效果和引起抗原性降低的可能机制进行综述，希望可以为低致敏乳制品研究和定向水解提供依据。

1 牛乳主要过敏原及其抗原表位

在牛乳中含有的30多种蛋白质中，主要的过敏原是酪蛋白(CN)、β－乳球蛋白(β－LG)及α－乳白蛋白(α－LA)，牛血清白蛋白(BSA)、免疫球蛋白(IDS)及乳铁蛋白(LF)被认为是次要过敏原［7］。

1.1 酪蛋白

酪蛋白占乳蛋白总量的78%～80%，包括四种类型:αs1－(40%)、αs2－(10%)、β－(35%)和κ－(12.5%)，四种酪蛋白通常聚合成悬浮在乳清中的微粒，它们都是磷酸化的蛋白质，其三级结构容易发生变化［1］。αs1－酪蛋白是由199个氨基酸残基组成的线性单链磷酸化蛋白，分子量为23 k Da，是酪蛋白中最主要的过敏原。每个分子中结合有8个磷酸根，大部分分布在45～89位，不含二硫键。其中，αs2－酪蛋白亲水性最强、分子量最大，在25 kDa左右。β－酪蛋白的性质最为稳定，疏水性和抗原特异性最强［8］。κ－酪蛋白结构性最高，对钙离子不敏感，是唯一含糖的酪蛋白。

线性表位(特定的氨基酸序列肽段)研究表明酪蛋白约包含60个IgE结合位点，αs1－、αs2－、β－和κ－酪蛋白分别占据20、17、13和10个［9］。对αs1－酪蛋白的研究中，已经得到了与T细胞结合的表位aa43～66，aa73～96，aa91～114，aa127～180［10］;IgG结合表位aa21～35，aa56～70，aa161～175，IgE结合表位aa6～20，aa11～25，aa126～140，aa171～185［11］;对αs1－酪蛋白进行生物信息学分析发现αs1－酪蛋白的1～16位是信号肽，无跨膜区，有3个糖基化位点、5个酪蛋白激酶磷酸化位点、3个蛋白激酶C磷酸化位点，通过IEDB数据库预测了αs1－酪蛋白的抗原区为aa16～29，aa45～50，aa52～54，aa56～70，aa74～75，aa77～86，aa94～104，aa142～152，aa173～179，aa185～210［12］。在αs2－酪蛋白表位研究中，发现了主要IgE结合表位aa83～100，aa143～158，aa157～172，aa165～188。另外，aa31～44，aa43～56，aa93～106，aa105～114，aa117～128，aa191～200是它的六个次要过敏表位［13］。

IgE结合表位aa1～16，aa83～92，aa135～144和IgG结合表位aa1～14，aa23～34，aa55～68，aa79～92，aa107～120，aa135～144，aa149～160，aa183～208，主要可以被B细胞结合，其中aa83～92和aa135～144是二者共有的表位［14］。在构象性表位的研究中，刘法辉［15］定位出β－酪蛋白的4个构象性表位;κ－酪蛋白的3个主要IgE表位:aa9～26，aa21～44，aa47～68可以被93%的患者血清结合，2个主要IgG表位为aa55～80和aa105～116。

1.2 β－乳球蛋白

β－乳球蛋白占牛奶乳清蛋白总量的50%以上，是公认的牛奶中最主要的过敏原之一，它含有162个氨基酸残基，分子量为18.3 kDa左右，等电点为5.3，有2个遗传变异体，由4个链内二硫键和1个链间二硫键连接组成，呈水溶性［16］。其能抵抗胃酸和胃蛋白酶的作用，进入血液循环从而引发过敏反应［15］。有文献统计，牛乳过敏人群中的82%是对β－乳球蛋白过敏［17］。

牛乳β－乳球蛋白中最主要的致敏表位为aa41～60，aa102～124，aa149～162，90%以上的牛乳过敏患者的T细胞都可以识别这三个表位［18］。目前随着对β－乳球蛋白的关注越来越深入，对其过敏表位的探究也日渐增多。通过酶法切割抗原定位出了IgE结合表位，最主要的有肽段aa102～124，aa41～60，aa149～162;主要过敏原表位有aa1～8，aa25～40;次要过敏原表位aa9～14，aa84～91，aa92～100［19］。利用病人血清通过肽扫描技术，定位出了牛乳β－乳球蛋白的IgE结合表位aa1～16，aa31～48，aa47～60，aa67～78，aa75～86，aa127～144，aa141～152，aa17～31，aa72～86，aa92～106，aa152～166和IgG结合表位aa1～16，aa51～64，aa67～78，aa85～96，aa129～144，aa139～156，aa22～36，aa127～141［20－21］。后期又通过肽扫描定位的方法找到了两个新的表位aa134～143，aa150～159［22］。在构象性表位(肽链折叠后一些特定氨基酸基团构成的特定空间构型)的研究中，发现了3个牛乳β－乳球蛋白表位L87～N88～N90～K91～E108～S110，I2～T4～P113～Q115～P144，T18～Y20～E44～E45～K47～E55～E157［23］。

1.3 α－乳白蛋白

α－乳白蛋白由123个氨基酸残基构成，其分子量为14.2 k Da，蛋白结构中有四个二硫键，并且对钙具有高亲和性。这保证了其二级结构和天然构象的稳定性［4］。α－乳白蛋白占乳清蛋白的25%，与人乳中的α－乳白蛋白同源性为74%，另有6%的氨基酸残基化学性质相似［24］。在线性表位方面，4个IgE表位aa1～16，aa13～26，aa47～58，aa93～102和3个IgG结合表位aa7～18，aa51～61，aa89～108，其中aa7～18，aa51～58为共识结合表位［21］。在对于α－乳白蛋白T细胞表位的研究中，发现了4个表位:aa19～36，aa25～42，aa31～48，aa43～60［25］。Adams等［26］在合成肽aa5－18中发现了α－乳白蛋白的IgE线性结合表位。丛艳君等［27］通过固相合成技术，合成α－乳白蛋白系列多肽并以牛乳过敏患者血清为探针，通过酶联免疫吸附分析法识别到α－乳白蛋白的5个IgE作用表位aa1～15，aa6～20，aa46～60，aa71～85，aa101～115;其中V8，F9，R10，Y103，L105，H107为影响α－乳白蛋白致敏性的关键氨基酸;并以相同方法定位α－乳白蛋白的IgG作用表位的氨基酸序列为aa6～20，aa21～35、aa36～50和aa86～100;关键氨基酸为F9、L15、P24、W26和H32。

2 生物酶解法水解牛乳蛋白技术

蛋白酶可以水解蛋白质肽链，破坏过敏蛋白的结构，从而显著降低蛋白质的过敏性。对于牛乳蛋白来说，蛋白酶可以将其水解为小分子乳蛋白、乳蛋白肽甚至是氨基酸，能够降低它的致敏性［28］。目前比较成熟的商品化酶主要有包括木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶在内的多种蛋白酶。不同的酶对应的酶切位点不同，如中性蛋白酶和菠萝蛋白酶没有特异性作用位点，胰蛋白酶主要水解Lys－或Arg－残基，胃蛋白酶水解芳香族氨基酸的N端或者C端，碱性蛋白酶作用于疏水性氨基酸的C端，木瓜蛋白酶内切Arg－、Lys－和Phe－残基等［29］。

早期对于酶解法的研究主要集中在用一种蛋白酶单独进行水解，后来发展为用两种以上的酶进行复合水解，起到彼此补充的作用。目前工业上生产配方乳粉大多采用成熟的热加工辅助酶解法。但是，在应用过程中，热加工辅助酶解法会影响乳产品的营养和感官品质。因此，用其他物理处理方法辅助酶解近年来也备受关注。

2.1 单酶水解牛乳蛋白

直接单酶法的研究重点是根据不同过敏原蛋白的性质而选择相应的蛋白酶。研究结果表明直接单酶法具有较为显著的效果。

αs1－酪蛋白分别被胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶水解，其中胰蛋白酶水解后，蛋白质的抗原性降低了85%，而胰凝乳蛋白酶在pH7.8时降低了63%。p H2.2时抗原性降低60%［30］。选用7种不同的生物酶水解酪蛋白［31］，中性蛋白酶水解效果最好，并且水解产物的抗原性显著降低。用5种酶水解酪蛋白的结果表明，碱性蛋白酶在降低酪蛋白抗原性方面效果最好，因为碱性氨基酸的裂解位点包含疏水氨基酸的羧基末端而酪蛋白中的疏水氨基酸含量比较高，因此酪蛋白可以水解得更加完全以获得所需的效果;但是木瓜蛋白酶不仅可以降低酪蛋白的抗原性，而且可以获得更好的酶解产物风味，从而得出木瓜蛋白酶更适合水解酪蛋白的结论［32］。汝成业等［33］筛选得到一株优先降解αs1－酪蛋白的产碱性蛋白酶菌株，但其游离酶稳定性较差，故采用海藻酸钠包埋法对纯化获得的碱性蛋白酶进行固定化，对αs1－酪蛋白作用的特异性较强，不影响乳制品的使用，同时可以提高回收率，实现多次使用。在乳清蛋白方面，有研究表明［34］，用胃蛋白酶和胰蛋白酶分别酶解100℃加热处理后的乳清蛋白，酶解产物的抗原性均显著降低。这是由于乳清蛋白包含相应的酶切位点。在酶解对乳清蛋白的抗原性影响研究中［35］，用7种生物酶分别水解乳清蛋白，碱性蛋白酶的效果最佳，主要原因是碱性蛋白酶的酶切位点中包含疏水性氨基酸的羧基，可以较大程度地使蛋白质分子内部的肽键断裂，从而达到破坏抗原表位的目的。

2.2 多酶复合水解牛乳蛋白

选用微生物内肽酶加外肽酶酶解乳清，水解产物经分子和细胞检测，酶解产物对肥大细胞脱颗粒的抑制作用较为明显，而对T细胞的刺激响应较慢［36］。Wroblewask等［37］分别尝试了单独使用碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶，以及二者混合使用，分别在水解开始时和水解1.5 h后再加入，水解相同时间，最终结果表明两种酶两步水解的效果最佳。在先用胰蛋白酶、风味蛋白酶单独水解，再用两种酶进行分步水解牛乳蛋白的实验中，三种方法均降低了α－乳白蛋白、β－乳球蛋白、酪蛋白，并且其中两种酶分步水解法对抗原性的降低程度最显著，得到的水解产物中小分子量(小于5 kDa)的肽段含量更高，产物中的苦味肽含量也最少［38］。有实验以牛乳β－酪蛋白为原料对其进行体外模拟消化，探讨胃肠消化条件下，胃蛋白酶、胰蛋白酶和复合酶连续消化产物的结构与功能特性，结果表明，复合酶消化产物水解度最大［39］。与单酶水解相比较，复合酶水解效果更好［40］，是因为不同酶的酶切位点可以互相补充，作用更多的致敏表位，实现多次切割，使蛋白质水解得更加完全，断裂成更小的肽段其包含完整抗原的可能性也更小［41］。

2.3 物理法－酶解法偶联技术

在酶解前或者酶解过程中与其他的物理方法偶联，是现在研究较多的一个方向。Ambrosi等［42］在不同的压力条件下用α－胰凝乳的蛋白酶和菠萝蛋白酶水解乳清蛋白，发现水解程度在一定范围内随着压力和时间的增加而增大，并且暴露出更多的抗原表位。压力的影响主要与蛋白质的去折叠有关，使其在天然结构中不易被接触到的酶作用区域暴露。高压导致完整的蛋白快速分解，使中等大小的肽段积累，然后再进一步被水解为更小的片段［43］。用BALB/c小鼠作为模型用于评估高压处理下用胃蛋白酶酶解得到的乳清蛋白水解产物的诱导过敏反应的能力，部分证实了高压水解产物的低致敏性［44－45］，另外，随着高压的压强、加压时间以及温度的变化，水解产物的抗原性也会受到影响，出现先上升后下降的情况［46］。通过微波辅助胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和混合酶分别水解乳清蛋白，发现微波辅助对降低乳清蛋白的抗原性具有显著作用［47］。在探究超声波预处理对菠萝蛋白酶水解乳清蛋白的影响的实验中，超声处理提高了蛋白质对菠萝蛋白酶的敏感性，显著提高了水解速率以及生物活性物质的转化速率，并且通过差示扫描量热法(DSC)观察到了超声处理引起蛋白质的变性和聚集［48］。超声同样可以使酪蛋白在低分子量区域的组分比例明显增加［49］，通过改变其结构特征而使抗原性降低。

通过单酶水解、复合酶水解和物理法辅助酶解技术得到的水解产物其抗原性显著降低，说明这些方法效果优良，并且不同方法的有机结合有效减少了对产物原有品质的影响。但是在实际应用中，具体酶的选用和处理方式对于产物的风味的影响还需进一步考虑。

3 生物酶法水解过敏原的机制

能够致敏的蛋白一般对胃肠道的消化功能有着较强的抵抗力，因此在体外预先对蛋白进行酶解是消除部分免疫原性的有效方法之一。酶的种类和水解能力直接影响蛋白质构象表位的破坏和线性表位的断裂，是完整的抗原表位能否存在的决定性因素［50］。比较常用的蛋白酶有植物源的菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶;动物源的胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶;微生物源的碱性蛋白酶、中性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶等。

用蛋白酶对乳蛋白进行限制性切割使致敏蛋白的肽键断裂成小分子肽段，能够达到降低其分子量的目的(破坏线性表位)，或者通过影响蛋白质的三级结构，去除蛋白质表面和空间中的的一些构象抗原表位，使其无法被识别，来降低抗原性［51］。在利用乳酸菌产酶水解乳清蛋白的研究中，随着蛋白酶的不断产生与积累，主要致敏蛋白的抗原性先降低，再上升，再降低，这是由于在经蛋白酶初步水解形成大肽后，一些隐形表位或线性表位被暴露出来，而随着时间延长，这些表位又逐渐被降解，从而造成了最终抗原性的降低［52］。在用胃蛋白酶、胰蛋白酶及复合酶水解牛乳蛋白的研究中，红外光谱和SDS电泳结果表明，酶解后，蛋白分子量由24 kDa降低到17、10 k Da等小分子量肽，二级结构破坏，α－螺旋含量下降，β－折叠含量下降，表面疏水性降低［35］。有研究利用一种丝氨酸蛋白酶对牛乳蛋白进行水解，发现乳清蛋白与酪蛋白随着水解度的增加，疏水性降低，同时抗原性也随之降低［53－54］。

目前，利用生物酶水解蛋白的工艺都具有一定的随机性，造成了水解产物的不稳定性。将过敏原蛋白的线性表位和构象性表位信息合理地与不同生物酶的特异性酶切位点进行搭配，针对性地破坏抗原表位，定向得到理想的低抗原性酶解产物，可以作为获得低致敏性乳蛋白的重要途径。

4 展望

目前，通过研究确定的牛乳蛋白中的抗原表位越来越丰富，抗原酶解技术日趋完善，配方奶粉的种类也越来越多。然而只利用蛋白酶进行水解，得到的水解产物具有很强的随机性，不能保证产物的组成。在未来的研究中，将已有的过敏原表位信息和生物酶的酶切位点特异性相结合，可能是比较高效的、得到低抗原性水解产物的方法。若再偶联合适的物理方法，则对致敏蛋白的水解效果可能更为有效，在此基础上，也可以尝试将化学等方法与酶解过程相结合，如此可以进一步完善脱敏技术，提高生产效率，为未来的低敏性奶粉的生产提供新的方向。