小贯小绿叶蝉EonuCSP14基因克隆与蛋白表达

周爽爽 刘荣

摘    要：本试验克隆了小贯小绿叶蝉（Empoasca onukii Matsuda）（原常称为假眼小绿叶蝉）的化学感受蛋白基因14（EonuCSP14）（GenBank后登录号为4YZPC5X701R），通过原核表达体系获得其重组蛋白，并通过蛋白纯化体系获得了纯蛋白，为小贯小绿叶蝉化学感受蛋白的功能研究奠定了基础。

关键词：小贯小绿叶蝉;化学感受蛋白;基因克隆;蛋白表达

文章编号：1005-2690（2021）24-0016-02       中国图书分类号：Q966;S435.711       文献标志码：B

小贯小绿叶蝉是茶树上为害较广的害虫，其为害严重威胁着我国的茶叶产量[1-2]。在关于害虫的绿色生态防控技术研究中，昆虫嗅觉识别机制是研究热点之一[3]。化学感受蛋白CSPs是存在于昆虫感器淋巴液中一类水溶性蛋白，分子量较小，其氨基酸序列具有Cys位点数量及位置保守的特征，是昆虫识别、运输外界化学信息物质的重要蛋白之一[4]，对CSPs功能的研究有助于完善昆虫嗅觉识别机制[5]。

1   小贯小绿叶蝉EonuCSP14基因克隆及分析

供试虫源采集于贵州省都匀市（26°13′E，107°30′N）茶园中，于冰上切下其触角并立即投入液氮保存备用。用Invitrogen公司的Trizol试剂提取叶蝉触角总RNA。用试剂盒合成cDNA第一条链。通过NCBI获得EonuCSP14基因序列，利用Primer 5.0设计引物后，由生物公司合成。经PCR扩增体系得到目的基因产物，电泳后利用AxyPrepTM DNA Gel Extraction Kit回收PCR产物，与pMD-18T Vector一起水浴（42 ℃，4 h），获取重组质粒，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。挑取单克隆测序，比对获得目的基因克隆体。利用“http：//web.expasy.org/compute_pi/”预测等电点、分子量，利用“http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/”预测N-末端信号肽序列。

2   小贯小绿叶蝉EonuCSP14的原核表达及纯化

试验菌株：克隆菌株pMD-18T-EonuCSP14-DH5，pET-32b空载体表达菌株。

主要仪器：SDS-PAGE蛋白电泳系统，蛋白纯化仪，超声波细胞粉碎机，酶标仪。……