不同蜱种E3泛素连接酶多态性分析*

秦 通 邢 丹 张美娜 施明杰 孙 毅** 蒋宝贵

(1.军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全国家重点实验室，媒介生物危害和自然疫源性疾病北京市重点实验室，北京 100071 2.中国人民解放军91638部队卫生所,北京 102202)

蜱是一种专性吸血的媒介节肢动物,广布于世界五大洲许多国家和地区(Andersonetal.,2008),且能将多种病原体(包括细菌、真菌、立克次体、原生动物、线虫、病毒及毒素等)传播给人类、牲畜和野生动物,引发多种蜱媒传染病的流行(Jiaetal., 2020),因此,蜱类及其传播的蜱媒疾病是当前传染病防控的重要对象,而其中影响或制约蜱媒病原传播的蛋白修饰或降解过程更是明确蜱媒病原传播分子机制、揭示病原—宿主相互关系的关键环节(Hajdušeketal., 2013)。

作为最普遍的蛋白质翻译后修饰因子之一,泛素在所有真核生物广泛存在且高度保守。由E1泛素激活酶、E2泛素结合酶和E3泛素连接酶组成的三级酶联反应组成的泛素化过程是生物体内蛋白质翻译后的修饰、降解的重要过程,是蜱类与病原体之间蛋白质相互作用的重要方式之一(Cabezas-Cruzetal., 2019)。其中，E3泛素连接酶因其严格控制泛素化反应的效率和底物特异性成为泛素化级联反应的关键成分(Zhengetal., 2017)。研究表明，E3泛素连接酶是细胞体液免疫所必需的。E3泛素连接酶VHL通过缺氧诱导因子1α(HIF-1α)依赖的糖酵解途径正向调节TFH细胞的早期启动，从而成为TFH细胞在急性病毒感染或抗原免疫时发挥功能所必需(Zhuetal., 2019)。一些病原体通过对宿主体内E3泛素连接酶的诱导与控制，实现在宿主体内的免疫逃逸或病原体的复制。如登革病毒2(DENV2)在感染期间通过激活未折叠蛋白反应(UPR)而诱导E3泛素连接酶SIAH1的表达,SIAH1与先天性免疫接头蛋白MyD88结合并泛素化,最终实现抑制宿主的先天免疫反应和促进登革病毒2(DENV2)复制(Schaferetal., 2020)。还有一些病毒，通过招募宿主的E3泛素连接酶来促进病毒的复制和释放。例如埃博拉病毒(EBOV)的VP40基质蛋白(EVP40)和马尔堡病毒(MARV)的VP40基质蛋白(MVP40),两者的PPxY型L结构域通过其WW结构域招募宿主的E3泛素连接酶，以促进病毒的复制和释放(Hanetal., 2016)。此外,E3泛素连接酶还参与了传染性病毒粒子的释放。E3泛素连接酶与拉萨病毒(LASV)、莫佩亚病毒(MOPV)和其他病毒的Z蛋白结合，参与了病毒样颗粒的释放和传染性子代病毒的释放(Bailletetal., 2020)。更有甚者，有些病毒利用自身病毒蛋白来携带E3泛素酶活性，从而达到病毒在宿主体内生存发展的某些条件，如新近发现的托斯卡纳病毒(Toscana virus, TOSV)，其非结构蛋白(Non-Structure Protein, NSs)本身就是负链RNA病毒中首次发现的一个具有非典型的RBR(RING between RING)结构的E3泛素连接酶，它是通过泛素化介导靶点蛋白降解、实现免疫逃避的主要功能单元(Gori Savellinietal., 2019)。因而，E3泛素连接酶在病原体的复制、扩散与免疫逃避等众多方面发挥着重要作用。本研究以真核生物体内普遍存在且高度保守的E3泛素连接酶为切入点，对主要媒介蜱类E3泛素连接酶的多态性进行初步探讨，以期为进一步揭示蜱虫对多种病原体的媒介作用的分子机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 标本来源

森林革蜱Dermacentorsilvarum：2020年4月采自内蒙古扎兰屯市巴林镇风景区(N47° 49′07″， S 122° 28′7″)，20只为一组，雄性(QTHTS_01)，雌性(QTHTS_02～03)。

全沟硬蜱Ixodespersulcatus和嗜群血蜱Haemaphysalisconcinna2020年7月采自牡丹江市海林县大石沟林场(N44° 59′26″， S 129° 38′12″)。20只为一组，全沟硬蜱雌性(QTHTS_04～05)、全沟硬蜱雄性(QTHTS_06)，森林革蜱雄性QTHTS_07)、森林革蜱雌性QTHTS_08)。

1.2 试剂来源

DNA/RNA共提试剂盒(DNA/RNA Isolation Kit)和不含RNA酶的DNA酶I(RNase-Free DNase I)均由天根生化科技(北京)有限公司提供。

1.3 核酸提取与高通量测序

根据高通量测序对样本浓度的要求，结合浓度差异以20只为测序单位，建立8组测序单位。委托北京诺禾致源科技股份有限公司进行RNA高通量测序。

1.4 序列及结构分析方法

利用软件CLC Genomics Workbench v3.6.1对所得的高通量数据进行分析，主要包括去杂(trinity)、拼接(assembly)、比对(alignment)、翻译(translation)等步骤获得可用的序列数据；再利用BLAST工具(www.ncbi.nlm.nih.gov)将所得的序列数据与GenBank中注册的基因序列进行同源性比较。与此同时,利用NCBI的保守域数据库(CDD)对获得的氨基酸序列结构进行注释(Marchler-Baueretal., 2011)并推断其功能位点。

表1 高通量测序结果Tab.1 High-throughput sequencing result

1.5 系统发育进化树的构建

以嗜群血蜱E3泛素连接酶CDS同源序列为基础，在已完成全基因组测序的长角血蜱(CM023451.1)中检索同源序列；同样，以肩突硬蜱E3泛素连接酶CDS在已完成基因组测序的全沟硬蜱(JABSTQ010009524.1)中检索同源序列；以此类推，我们获得了亚洲璃眼蜱(CM023483.1)的E3泛素连接酶CDS同源序列。同时,从GenBank获得其他相关节肢动物的E3泛素连接酶编码序列，包括软蜱科图卡钝缘蜱Ornithodorosturicata、森林革蜱D.silvarum、网纹革蜱D.reticulatus、亚洲璃眼蜱Hyalommaasiaticum、肩突硬蜱I.scapularis、蓖子硬蜱I.ricinus、微小扇头蜱Rhipicephalusmicroplus、血红扇头蜱R.sanguineus、丽色扇头蜱R.pulchellus、黄色大蜜蜂Apisdorsata、丽蝇蛹集金小蜂Nasoniavitripennis、大腹鬼蛛Araneusventricosus、横纹金蛛Argiopebruennichi等。基于这15个节肢动物的E3泛素连接酶CDS同源序列，以黑猩猩Pantroglodytes为外群，采用邻接法Neighbor-Join 和 BioNJ 算法构建基于E3泛素连接酶SH3RF异构体编码序列遗传距离的系统发育树，并对模型进行最大似然估计(Maximum Composite Likelihood approach, MCL)以评价系统发育的有效性，NJ的构建与评估由MEGA7.0系统完成。

2 结果

2.1 高通量质量评估

8组测序结果整体测序错误率均小于5%(表1)，原始读长数与清洁读长数十分接近，表明此次高通量测序质量较高，结果可信。

2.2 媒介蜱类E3泛素连接酶的系统发育关系

从8组样品分别获得了与已知蜱类E3泛素连接酶高度同源(氨基酸序列大于80%)的编码序列，经Blast同源比对从森林革蜱发现E3泛素连接酶高度同源序列2条(MW354543、MW354544)、嗜群血蜱1条(MW354545)。森林革蜱、嗜群血蜱的同源序列同已知的森林革蜱E3泛素连接酶SH3RF3异构体的同源性分别达到99.30%～99.56%(森林革蜱)和76.29%(嗜群血蜱)，而同肩突硬蜱E3泛素连接酶SH3RF3异构体差异较大，同源性仅达64.01%～66.11%(森林革蜱)和72.38%(嗜群血蜱)(表2)。

E3泛素连接酶SH3RF3异构体的氨基酸序列在进化中表现出种属特异性特征，且这些特征差异随蜱种的分类地位和系统进化关系逐渐分化(图1)；其中，以图卡钝缘蜱Ornithorodosturicata为代表的软蜱科与硬蜱科之间形成了明显的分支；硬蜱科中以硬蜱属为代表的硬蜱亚科形成独立分支，同扇头蜱亚科(革蜱属Dermacentor、扇头蜱属Rhipicephalus)、璃眼蜱亚科(璃眼蜱属Hyalomma)以及血蜱亚科(血蜱属Haemaphysalis)差异显著；而后三者中，血蜱亚科分化较远，璃眼蜱亚科次之，扇头蜱亚科中的革蜱属和扇头蜱属则比较接近。

表2 高通量测序所获得得蜱类E3泛素连接酶Tab.2 The E3 Ubiquitin Ligase sequences obtained by high throughput sequencing

图1 基于E3泛素连接酶SH3RF3异构体氨基酸序列的系统进化树Fig.1 Phylogenetic analysis based on E3 ubiquitin ligase SH3RF3 amino acid sequences of different vector tick species

2.3 主要媒介蜱类E3泛素连接酶的结构多态性特征

图2 主要蜱类E3泛素连接酶结构域推测Fig.2 Conserved domain speculation of E3 ubiquitin ligase of major ticksa: E3泛素连接酶SH3RF3结构模式图; b: E3泛素连接酶SH3RF2结构模式图; c: 森林革蜱E3泛素连接酶保守结构域(MW354543、MW354544); d: 全沟硬蜱E3泛素连接酶保守结构域; e: 嗜群血蜱E3泛素连接酶保守结构域; f: 长角血蜱E3泛素连接酶保守结构域; g: 亚洲璃眼蜱E3泛素连接酶保守结构域.a: Conserved domain on E3 ubiquitin-protein ligase SH3RF3; b: Conserved domain on E3 ubiquitin-protein ligase SH3RF2; c: Conserved domain speculation on Dernacentor silvarum MW354543 and MW354544; d: Conserved domain speculation on Ixodes persulcauts; e: Conserved domain speculation on Haemaphysalis concinna MW354545; f: Conserved domain speculation on Haemaphysalis longicornis; g: Conserved domain speculation on Hyalomma asiaticum.

测序获得的森林革蜱E3泛素连接酶(MW354543)与GenBank中的E3 ubiquitin-protein ligase SH3RF3-like isoform X1 [D.silvarum]虽然在氨基酸序列上偶有变化，但是在5个结构域的序列比对结果完全一致(图2-c)；MW354544除在起始的N端的环指结构RING-HC_SH3RF3存在大量的缺失外，C端的SH3_SH3RF_C和3个SH3保守域完全相同(图2-c)。可见，森林革蜱转录获得的MW354543、MW354544应为SH3RF3型E3泛素连接酶，该酶在转录过程可出现N端的环指结构缺失现象。同时，从全沟硬蜱Ixodespersulcatus(JABSTQ010009524.1)中检索获得E3泛素连接酶与肩突硬蜱SH3RF3的5个保守结构域同源性高度一致(图2-d)，亦为SH3RF3型。

嗜群血蜱E3泛素连接酶(MW354545)仅包含位于N端的RING锌指结构域和接下来的3个SH3域(SH3_SH3RF2_1、SH3_SH3RF2_1、SH3_SH3RF2_3)，没有C端的SH3_SH3RF2_C (Luetal., 2020)(图2-e)。SH3域又称为POSHER，其功能是消除RING蛋白或心脏蛋白磷酸酶1结合蛋白 (HEPP1)。SH3RF3有4个SH3结构域。与之不同，SH3RF2型E3泛素蛋白连接酶仅具3个SH3域(图2-a、图2-b)。依据结构特征, 嗜群血蜱的MW354545应为SH3RF2型E3泛素连接酶。同样，从基因组测序检索获得的长角血蜱(CM023451.1)E3泛素连接酶在RING-HC结构域和3个SH3域同嗜群血蜱同源性高度一致，保守域结构也完全一致(图2-f)，应为SH3RF2型。

亚洲璃眼蜱Hyalommaasiaticum(CM023483.1)的全基因组中检索获得的E3泛素连接酶序列结构复杂，不属于已知的SH3RF1、SH3RF2和SH3RF3(图2g)，可能为中间类型。

3 讨论

泛素化是生物体普遍存在的、调控蛋白质合成、加工、代谢过程的重要生理机制。泛素化过程是由E1泛素激活酶、E2泛素结合酶和E3泛素蛋白连接酶组成的三酶级联反应。E1酶以依赖于三磷酸腺苷的方式激活泛素并将其转移到E2酶上，E2酶的活性位点半胱氨酸与泛素的C端羧基形成硫酯键。E3泛素连接酶与同时负载泛素的E2酶和特定底物相互作用介导泛素的转移，最终在底物的赖氨酸ε氨基和泛素的C端羧基之间形成异肽键。E3泛素连接酶因其严格控制泛素化反应的效率和底物特异性，所介导的泛素与底物结合形式复杂多样，是泛素化级联反应过程的关键成分(Zhengetal., 2017)。目前，根据E3连接酶的特征结构域和泛素转移蛋白底物的机制，可分为3种主要类型：(1)RING E3s，这是泛素连接酶中含量最丰富的一种类型，其特征是存在1个被称为RING的锌结合结构域或者是1个U-box结构域，能介导泛素直接转移到底物上、发挥支架的作用。(2)HECT E3s, 其功能是通过两步反应催化泛素转移到蛋白底物，泛素首先转移催化E3上的半胱氨酸，然后再从E3转移到蛋白底物。(3)RBR E3s，其功能同样是通过两步反应催化泛素转移，RBR名称源于两个预测的环状域(RING1和RING2)的存在，两个环状域由环间结构域(IBR)分隔(Morreale et al., 2016)。其中，SH3RF3是具有活性的E3泛素蛋白连接酶的支架蛋白，它包含5个保守域，分别是位于N端的RING-HC_SH3RF3与4个SH3结构域。SH3RF1与SH3RF3高度同源，也具4个SH3域；与之不同，SH3RF2型E3泛素蛋白连接酶仅具3个SH3域。SH3结构域以其中等亲和力和选择性，优先于PxxP基序同富含脯氨酸的配体特异性结合，在细胞中发挥着酶促反应调节、信号通路组分的亚细胞定位以及介导多蛋白复合物装配等多种功能 (Luetal., 2020)。

泛素化机制在节肢动物中普遍存在，果蝇E3泛素连接酶CTRIP和Slimm/β-TrCP被证实具有调节生物钟(Lamazeetal., 2011)和维持体内铜稳态的生理作用 (Zhangetal., 2020)。更为重要的是泛素化机制在媒介节肢动物感染和传播病原微生物的过程中也发挥十分重要的生理作用。库蚊体内的泛素连接酶Cullin 4(cullin RING ubiquitin ligase)具有亲病毒性，上调表达的Cullin 4可促进西尼罗病毒(WNV)在库蚊体内的复制(Paradkaretal., 2015)。肩突硬蜱体内的E3泛素连接酶XIAP会调控嗜吞噬细胞无形体在其体内的定植(Severoetal., 2013)。果蝇体内的E3泛素连接酶dSmurf是神经胶质细胞突触重塑和轴突修剪所必需的重要成分(Chenetal., 2017)，雌性果蝇突触复合体的组装和分解也受体内E3泛素连接酶Sina的调节(Hughesetal., 2019)。由此可见，深入分析媒介节肢动物的泛素化作用特征及其介导的传播效能将是明确病原—媒介和宿主关系的重要契机。

本研究发现，不同蜱种转录表达的E3泛素连接酶在种类和亚型(异构体)方面呈多样化态势，这种多样化态势是否同感染的特定蜱媒病原体(莱姆病螺旋体(Andersonetal., 1991)、森林脑炎(Dumpisetal., 1999)等)、抑或与蜱类吸血状态相关，尚需深入系统地开展研究。 除此之外，尽管基因组检索证实了E3泛素连接酶SH3RF3亚型的存在，但事实上3组60只全沟硬蜱均未获得SH3RF亚型同源序列的转录结果，其可能的原因是(1)E3泛素连接酶编码基因可有选择性地转录和表达，在特定情况下，病毒等病原体相关核酸小分子(dsRNA、siRNA)的干扰沉默可导致不表达。(2)病毒等病原体的感染诱发了蜱类泛素化蛋白修饰机制，转录、表达的SH3结构功能蛋白瞬时被C Jun氨基末端激酶(C Jun-N-terminal Kinase, JNK)通路中的POSHER(消除)作用完全消耗。POSHER过程需要大量的泛素化支架蛋白以充当蜱类靶标器官或组织抗凋亡调节剂。鉴于泛素化蛋白修饰机制在诸多病原体的感染、传播、宿主调节和免疫逃逸中发挥着重要作用，媒介生物E3泛素连接酶对不同病原体介导作用及其内在分子机制也是亟待深入探讨的基础性科学问题。譬如，近年来肆虐的发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)已经证实可通过长角血蜱进行经卵和经期传播(Zhuangetal., 2018)，但该病毒对媒介蜱种的选择性是否与长角血蜱E3泛素连接酶的特异性表达相关，还有待进一步研究。