碳氮磷营养对百蕊草悬浮培养细胞生长的影响

黄燕芬 ，王自布，施 琴 ，谢 奇

(1.贵州师范学院生物科学学院，贵州 贵阳 550018；2.贵州省生物资源开发利用特色重点实验室，贵州 贵阳 550018)

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料为用野生百蕊草叶为外植体诱导的生长旺盛、质地松散的淡黄色愈伤组织。

1.2 方法

1.2.1 悬浮培养细胞系的建立及培养基质中碳、氮、磷消耗量检测 取供试愈伤组织，切成小块或夹碎接种于液体培养基BRCIII (MS+6-BA 3 mg/L+NAA 0.15 mg/L+2，4-D 0.3 mg/L+30 g/L蔗糖，pH 5.7～5.9)中培养。培养温度(24±1)℃，培养箱转速115 r/min，每个锥形瓶(容量100 mL)内装40 mL培养液，每瓶接种量约2 g，于黑暗处培养2～3 d后转移至弱光处培养。在悬浮培养初期(3～5 d)用0.425 mm的无菌过滤筛对培养物过滤1次，除去大细胞团和组织块，保留分散程度好的小细胞团及单细胞。每3 d 显微观察1次，并弃去上液，按1/3体积比(原液/新鲜培养液)转入新鲜培养液。观察见细胞团较小，分散度、均一性较好，悬浮细胞呈浅黄色，生长状态稳定，生物量迅速增加时即可作为种子细胞液。取1份种子细胞液、3份新鲜培养液进行悬浮培养，每间隔2 d 取1次悬浮细胞培养液(连续取样30 d)，测定细胞生长量，绘制悬浮细胞生长曲线，同时测定培养基质中碳、氮、磷消耗量。

1.2.2 筛选培养基质最适氮、磷源浓度 将培养基BRCIII中总氮设置7种起始浓度，即50、55、60、65、70、75和80 mmol/L，磷酸盐设置5种起始浓度，即1.20、1.25、1.30、1.35和1.40 mmol/L，均为3次重复。按照1.2.1方式接种种子细胞液于不同氮、磷起始浓度培养基中培养至第28天时，分别测定细胞干物质量，筛选最适氮、磷起始浓度。

1.2.4 细胞生长情况检测 用布氏漏斗抽滤悬浮培养系除去培养液，再以蒸馏水冲洗、抽滤3次，尽量抽去胞间隙水分，最后将细胞于50 ℃烘干至恒重[15]，按照下列公式计算细胞干物质量和细胞生长速率。……