乙醇对右旋糖酐酶酶解作用的影响

问清江，慕 娟，郑巧霞，孙晓宇，丁 浩

(陕西省微生物研究所，陕西 西安 710043)

右旋糖酐酶(Dextranase，EC 3.2.1.11)为糖苷水解酶，能够专一性地水解右旋糖酐(Dextran)分子中的α-1,6葡萄糖苷键，降解为小分子的右旋糖酐、异麦芽糖、异麦芽三糖、葡萄糖及少量的多聚糖。右旋糖酐酶在医药、食品、化工等领域具有广泛应用。右旋糖酐酶可用于龋齿的防治[1]。右旋糖酐酶用于制糖业，甘蔗汁中的污染微生物将蔗糖转化为高黏度、高分子量的α-葡聚糖，影响生产效率和产品品质，右旋糖酐酶可以降解去除α-葡聚糖，使蔗糖生产效率和产品品质得以保证。右旋糖酐酶水解高分子右旋糖酐制备低分子药用右旋糖酐，由于其具有专一性和高效性，可以提高水解效率，降低能耗，改善产品品质。现有的药用右旋糖酐生产工艺是肠膜状明串珠菌发酵将蔗糖转化为葡聚糖(右旋糖酐)，利用乙醇沉淀法从发酵液分离右旋糖酐(粗酐)，右旋糖酐沉淀经盐酸水解分离纯化为一定分子量的药用右旋糖酐产品。粗酐中有乙醇残留，将右旋糖酐酶引入药用右旋糖酐生产工艺中替代盐酸水解高分子右旋糖酐，必须考虑粗酐中的残留乙醇对右旋糖酐酶水解右旋糖酐的影响。通过对乙醇对右旋糖酐酶酶解反应的影响、乙醇对右旋糖酐酶稳定性的影响及不同浓度乙醇对右旋糖酐酶酶解右旋糖酐的影响等研究，为右旋糖酐酶应用于右旋糖酐生产提供一定的技术数据和条件。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 右旋糖酐酶(宁夏夏盛实业集团有限公司)。

1.1.2 试剂 葡萄糖(D-(+)-Glucose),Sigma 公司产品；3,5-二硝基水杨酸(CP)；乙醇(AR)；其他试剂为市售分析纯。

1.1.3 粗酐(陕西省微生物研究所自制)。

1.1.4 仪器 722分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)；85-2数显恒温磁力搅拌器(杭州仪表电机有限公司)；101型电热鼓风干燥箱(北京科伟永兴仪器有限公司)；2010A-HT高效液相色谱仪(苏州贝锐仪器科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 乙醇对右旋糖酐酶解反应的影响 在pH5.0，温度50℃，时间10min的反应条件下，分别以含有0、5%、10%、15%、20%、25%、30%不同浓度乙醇的1%的右旋糖酐作为底物进行右旋糖酐酶解反应，检测水解液中的还原糖(以葡萄糖计)，以确定乙醇对右旋糖酐酶解反应的影响。

1.2.2 乙醇对右旋糖酐酶稳定性的影响

1.2.2.1 在4℃条件下乙醇对右旋糖酐酶稳定性的影响

以5%、10%、15%、20%、25%、30%不同乙醇浓度的溶液分别稀释右旋糖酐酶(相同的稀释倍数)，将稀释酶液放置4℃冰箱24 h，然后测定酶活。

1.2.2.2 乙醇对右旋糖酐酶热稳定性的影响

用2.5%、5.0%、7.5%、10.0%乙醇溶以相同的稀释倍数液分别稀释右旋糖酐酶，在50℃水浴保温5h，每1h取样检测右旋糖酐酶活力，得出残余酶活而确定乙醇浓度对右旋糖酐酶在50℃条件下稳定性的影响。

1.2.3 乙醇对右旋糖酐酶解的影响 右旋糖酐酶在6%右旋糖酐浓度，50℃，乙醇含量分别为2.5%、5.0%、7.5%、10.0%、12.5%、15.0%、17.5%和20.0%的条件下水解右旋糖酐，每隔30 min取样检测和旋糖酐分子量分布。水解结束后乙醇沉淀、50℃烘干，测定分子量分布。

1.2.4 右旋糖酐酶活力的测定[2]采用DNS法测定右旋糖酐酶活力。配制1 mg·mL-1葡萄糖标准溶液，分别量取0.3、0.35、0.4、0.45、0.5 mL果糖标准溶液，用蒸馏水补齐1 mL，再加入2 mLDNS，沸水浴2 min，流水冷却后加蒸馏水至10 mL，在540 nm测定光吸收值，绘制葡萄糖标准曲线，得出回归方程用于葡萄糖含量和右旋糖酐酶活力测定。将酶液用一定pH值的缓冲液适当稀释后，取0.5 mL的酶液加入到0.5 mL1%的右旋糖酐溶液中，50℃准确反应10 min，加入2 mLDNS终止反应，沸水浴2 min显色，然后流水冷却至室温，定容至10 mL；空白对照，0.5 mL1%的右旋糖酐溶液50℃准确反应10 min，先后加入2 mLDNS和0.5 mL的酶液，沸水浴2 min显色，然后流水冷却至室温，定容至10 mL。以蒸馏水为对照测定540 nm的吸光值，样品和空白对照的吸光值之差根据回归方程得出反应液中的葡萄糖量，从而确定酶活。酶活力单位定义：在上述条件下，每分钟催化右旋糖酐产生1 μmol葡萄糖所需要的酶量定义为1个酶活力单位(IU)。

1.2.5 分子量与分子量分布[3]取样品适量，加流动相溶解并稀释制成每1 mL约含10 mg的溶液，振摇，室温放置过夜作为供试品溶液。另取4～5个已知分子量的右旋糖酐对照品，依法检测(2020版《药典》二部附录VH)。

2 结果与分析

2.1 乙醇对右旋糖酐酶作用的影响

在pH5.0，温度50℃，时间10 min的反应条件下，分别以含有5%、10%、15%、20%、25%、30%不同浓度乙醇的1%的右旋糖酐作为底物进行右旋糖酐酶解反应，结果见图1。底物中乙醇浓度从5.0%～30.0%，右旋糖酐酶解液还原糖(以葡萄糖计)的含量与不含乙醇的对照相比较，无明显差异，说明在这一反应条件下，乙醇对右旋糖酐酶酶解反应本身无影响。

图1 乙醇对右旋糖酐酶作用的影响

2.2 乙醇对右旋糖酐酶稳定性的影响

2.2.1 在4℃条件下乙醇对右旋糖酐酶稳定性的影响 右旋糖酐酶在5%～30%乙醇溶液中，4℃放置24h后检测其残余酶活力(图2)，不同浓度乙醇溶液中的残余酶活力与对照相比较，均没有明显差异，说明在4℃条件下，右旋糖酐酶在5%～30%乙醇溶液中相对稳定。

图2 4℃条件下乙醇对右旋糖酐酶稳定性的影响

2.2.2 乙醇对右旋糖酐酶热稳定性的影响 右旋糖酐酶用不同浓度的乙醇溶液稀释20倍后放入50℃水浴保温5 h，每隔1 h取样检测残存酶活力，结果见图3。在1 h 取样时发现溶液中有沉淀产生，且随着乙醇浓度的增加沉淀增多，在热的乙醇溶液(50℃)中造成酶蛋白凝聚变性而失活，乙醇浓度越大，这种现象越严重。2.5%乙醇溶液中残余酶活力随时间降低的趋势最缓，乙醇浓度增大变化加快，10.0%乙醇溶液中残余酶活力降低最快。1 h时，2.5%、5.0%、7.5%和10.0%的乙醇溶液中的酶活残存率分别为73.65%，62.67%，41.58%和31.13%，而无乙醇溶液中的酶活残存率为93%[4]。5 h时，2.5%、5.0%、7.5%和10.0%的乙醇溶液中的酶活残存率分别为43.83%，30.13%，22.46%和21.47%。在4℃的乙醇溶液(5%～30%)中没有这种现象发生，说明乙醇对右旋糖酐酶的热稳定性有影响，因此在用右旋糖酐酶降解右旋糖酐时必须考虑到这一点。

图3 右旋糖酐酶在乙醇溶液中的热稳定性

2.3 乙醇对右旋糖酐酶解的影响

在右旋糖酐酶解时加入2.5%、5.0%、7.5%、10.0%、12.5%、15.0%、17.5%、20.0%不同浓度的乙醇，水解进程中取样检测右旋糖酐分子量的分布(图4-图7)。乙醇浓度为2.5%和5.0%的水解进程与无乙醇相比较(图4，图6)，水解趋势基本一致，2.5h的重均分子量分别为17 092和17 101，与无乙醇重均分子量12 025相比较，同处于10 000～20 000之间，说明在乙醇含量5.0%以下对右旋糖酐的酶解影响较小。乙醇浓度为7.5%、10.0%、12.5%、15.0%时(图4-7)，虽然重均分子量随时间延长降低，但水解度的差异显现，2.5 h的重均分子量分别为26 050，26 929，25 351、26 416，与无乙醇重均分子量差距进一步扩大，表明乙醇浓度7.5%～15.0%对右旋糖酐酶解的影响处于一个水平，但与5.0%以下比较，影响明显增大。乙醇浓度为17.5%和20.0%的降解速率明显变慢(图5)，水解度降低(图6-图7)，2.5 h的重均分子量分别为42 893和95 025，3.0 h的重均分子量分别为31 887和77 759，右旋糖酐酶解液中乙醇浓度为17.5%以上会对水解产生极强地影响。

图4 不同乙醇浓度右旋糖酐酶解进程(1)

图5 不同乙醇浓度右旋糖酐酶解进程(2)

图6 2.5 h不同乙醇浓度水解液中右旋糖酐分子量分布

图7 3.0 h不同乙醇浓度水解液中右旋糖酐分子量分布

在2.1中右旋糖酐酶酶解反应是底物和酶液分别为0.5 mL，酶解液中的乙醇含量实际是2.5%、5.0%、7.5%、10%、12.5%、15.0%，反应时间10 min，在这样的条件下尽可能避免了右旋糖酐酶在50℃乙醇溶液中凝聚变性活力受损，底物中乙醇浓度在30%以下对右旋糖酐酶作用本身基本没有影响，乙醇不影响右旋糖酐酶的作用。在2.1中，低温(4℃)下30%以下的乙醇溶液对右旋糖酐酶的稳定性不会产生影响，但是在50℃，2.5%乙醇溶液中右旋糖酐酶在1h时酶蛋白凝聚沉淀产生使酶活力受损，随着时间的延长，沉淀增加，活力受损增加，随着乙醇浓度的增加，右旋糖酐酶活力随时加剧，因此在单纯的乙醇溶液中，右旋糖酐酶的热稳定性较差。不同乙醇浓度条件下的右旋糖酐酶解结果表明，2.5%～20.0%乙醇含量虽然不同程度的影响到酶解，但是在相对应的乙醇浓度下没有单纯乙醇溶液中酶活损失而产生的影响大，原因在于，有右旋糖酐的存在，抑制了酶蛋白凝聚变性的产生，减少了右旋糖酐酶活力受损的速率和强度。乙醇对右旋糖酐酶解的影响因乙醇浓度的不同而不同，5.0%以下影响较小，7.5%～15.0%影响在同一的水平，17.5%以上影响加剧。因此，在右旋糖酐酶解工艺过程中，乙醇对右旋糖酐的酶解的影响是可控制的。

3 讨论

现有的右旋糖酐原料药生产工艺是将高分子的右旋糖酐从右旋糖酐发酵液中用乙醇沉淀分离为粗酐，沉淀直接溶解为一定浓度的右旋糖酐溶液，加入盐酸水解为一定分子量分布的低分子右旋糖酐，乙醇分离纯化为目标分子量分布的药用右旋糖酐。由于粗酐没有干燥，一定有乙醇残存，生产企业的实际情况是发酵水平高低、分离提取等因素导致粗酐乙醇残留高低不同，表现在右旋糖酐水解液中乙醇含量在1.0%～15.0%之间，因此在水解工艺中引入右旋糖酐酶代替盐酸，必须考虑残留乙醇对右旋糖酐酶作用的影响。在2.1中的反应条件下，底物中乙醇浓度从5.0%～30.0%的右旋糖酐酶酶解反应表明，右旋糖酐溶液中乙醇含量30.0%以下对右旋糖酐酶酶解反应本身无影响。低温(4℃)条件下，右旋糖酐酶在30%以下的乙醇溶液中相对稳定。在热的乙醇溶液(50℃)中造成酶蛋白凝聚变性而失活，乙醇浓度越大，这种现象越严重，不同的乙醇浓度，右旋糖酐酶活力损失不同，1 h时，2.5%、5.0%、7.5%和10.0%的乙醇溶液中的酶活残存率分别为73.65%，62.67%，41.58%和31.13%，5 h时，2.5%、5.0%、7.5%和10.0%的乙醇溶液中的酶活残存率分别为43.83%，30.13%，22.46%和21.47%。乙醇对右旋糖酐的酶解影响结果表明，不同乙醇含量影响不同，右旋糖酐酶解液中乙醇含量5%下影响甚微，7.5%～15.0%影响进一步增大，但基本维持在同一的水平，17.5%以上影响剧烈，因此需要在右旋糖酐酶解时根据粗酐乙醇残留不同，采用不同的工艺条件参数，同时需要加强发酵等上游工艺条件控制，尽可能的使粗酐中的乙醇残留稳定在一定范围，从而保证右旋糖酐的酶解。右旋糖酐酶替代盐酸水解右旋糖酐生产右旋糖酐原料药，虽然粗酐中的乙醇残留会影响右旋糖酐酶的作用，但是是可以控制的。毕竟右旋糖酐酶具有的专一性、高效性等特点，使得右旋糖酐水解温度从90～95℃降低到50℃，大大降低能耗，不增加原材料的费用，避免了盐酸使用对设备的特殊要求和环保负荷，改善产品品质。总之右旋糖酐酶用于右旋糖酐原料药的生产具有良好的前景。