血清Nε-羧甲基赖氨酸水平与2型糖尿病患者颈动脉钙化的关系

翁悦，蒋成燕，巴俊强，虞萌

遵义市第一人民医院，贵州遵义563000

动脉钙化是2 型糖尿病（T2DM）的主要并发症，是导致T2DM 患者并发心脑血管疾病的主要因素之一［1］。高血糖、胰岛素抵抗可损伤血管内皮功能，加剧氧化应激反应和动脉钙化进程，T2DM 患者较正常人群发生心脑血管疾病的风险增加2～4 倍［2］。颈动脉是动脉钙化好发部位，也是反映全身动脉钙化的窗口，颈动脉超声评价颈动脉钙化程度有助于评估T2DM 患者心血管疾病风险［3］。但是颈动脉超声并不能发现颈动脉管壁出现形态学改变之前的微小变化以及深部血管钙化情况，因此研究与颈动脉钙化相关的生物学指标十分必要。Nε-羧甲基赖氨酸（CML）是晚期糖基化终产物之一，被认为是强烈的促血管钙化剂［4］，可通过激活CML/晚期糖基化终产物受体信号诱导活性氧/p38/丝裂素活化蛋白激酶介导的动脉钙化级联反应，促使动脉粥样硬化进程［5］。本研究检测 T2DM 患者血清 CML 水平，分析其与颈动脉钙化的关系，为颈动脉钙化评估提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2017年5月—2019年10月本院超声科行颈动脉超声检查的T2DM 患者132 例，纳入标准：①符合2017 版《中国2 型糖尿病防治指南》诊断标准［6］；②年龄>18岁；③既往无动脉粥样硬化或心脑血管疾病。排除标准：①1 型糖尿病、妊娠期糖尿病；②既往心脑血管疾病；③先天性颈动脉畸形、动脉瘤。另选择51例门诊体检健康志愿者为对照组，均排除高血压、糖尿病、高脂血症、心脑血管疾病等。本研究获得医院医学伦理会批准，患者及其家属均签署知情同意书。

1.2 血清CML检测 T2DM患者于入院24 h 内、对照组于体检当日采集空腹肘静脉血5 mL，于4 ℃，3 000 r/min 离心 15 min，离心半径 15 cm，取血清保存于-80 ℃超低温冰箱。检测时室温下复融血标本，用酶联免疫吸附法检测血清CML。酶标仪购自Synergy HTX 基因有限公司，型号1608301A；试剂盒购自北京科美东雅生物技术有限公司。上述检测均由本院中心试验室完成，控制批次变异在6%以内。

1.3 颈动脉钙化检测 两组检查前禁用血管舒张或收缩药物，平静休息30 min。采用Philips iU 22彩超诊断仪，让患者平卧，暴露颈部，二维灰阶超声显示颅外段椎动脉血管走行方向，探查管壁内或突出于管腔的高回声为颈动脉钙化，每条血管选择钙化最严重病变部位，根据钙化长度进行评分，钙化长度<0.1 cm 为无血管钙化，计0 分，0.1 cm≤钙化长度≤1 cm 计 1 分，1 cm<钙化长度≤2 cm 计 2 分，2 cm<钙化长度≤3 cm 计 3 分，>3 cm 计 4 分。双侧钙化积分之和为最终得分，1～4 分为低钙化，5～8 分为高钙化［7］。根据颈动脉超声检查结果将其分为钙化组（92例）和无钙化组（40例），根据钙化积分将钙化组分为高钙化组（58例）和低钙化组（34例）。

1.4 临床资料收集 收集各组临床资料，包括年龄、性别、BMI、吸烟史、饮酒史、基础疾病（高血压、高脂血症）、心脑血管疾病家族史、糖尿病病程、收缩压、他汀类药物使用情况及生化指标［TC、FPG、空腹胰岛素（FINS）、胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）］。

1.5 统计学方法 采用SPSS25.0 统计软件。计量资料用±s表示，比较采用单因素方差分析或独立样本t检验；Spearman 秩相关分析CML 与钙化积分之间的相关性；Logistic 二元逐步回归分析T2DM 患者颈动脉钙化的危险因素；绘制受试者工作特征（ROC）曲线，用曲线下面积（AUC）评价CML 诊断T2DM 患者颈动脉钙化的价值。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 钙化组、无钙化组、对照组临床资料比较 钙化组男 59 例、女33 例，年龄（63.75 ± 3.69）岁，BMI（26.13 ± 2.36）kg/m2，有吸烟史51 例、饮酒史38 例，伴高血压53 例、高脂血症62 例，心脑血管疾病家族史29例，T2DM病程（6.35±1.24）年，使用他汀类药物 23 例；无钙化组男 28 例、女 12 例，年龄（62.84 ±3.53）岁，BMI（23.21 ± 2.42）kg/m2，有吸烟史15 例、饮酒史12 例，伴高血压15 例、高脂血症19 例，心脑血管疾病家族史13例，T2DM病程（5.03±0.94）年，使用他汀类药物17 例；对照组男29 例、女22 例，年龄（62.05 ± 3.42）岁，BMI（22.79 ± 2.15）kg/m2，有吸烟史18 例、饮酒史15 例，心脑血管疾病家族史19例。三组年龄、性别、饮酒史、心脑血管疾病家族史比较差异均无统计学意义（P均>0.05）。钙化组BMI、有吸烟史比例、收缩压、TC、FPG、FINS、HOMAIR、血清CML 水平高于无钙化组、对照组（P均<0.05）。无钙化组收缩压、TC、FPG、HOMA-IR、FINS、CML 高于对照组（P均<0.05），BMI、有吸烟史比例与对照组比较差异均无统计学意义（P均>0.05）。钙化组合并高血压比例、合并高脂血症比例、T2DM 病程高于无钙化组，使用他汀类药物比例低于无钙化组（P均<0.05）。见表1。

表1 钙化组、无钙化组、对照组临床资料比较（±s）

表1 钙化组、无钙化组、对照组临床资料比较（±s）

注：与对照组比较，aP<0.05；与无钙化组比较，bP<0.05。

组别钙化组无钙化组对照组F P n 92 40 51收缩压（mmHg）138.45±6.35ab 130.82±4.19a 126.42±3.12 12.034<0.05 TC（mmol/L）5.72±0.42ab 5.07±0.29a 4.21±0.26 15.052<0.05 FPG（mmol/L）12.49±3.42ab 10.24±2.76a 4.05±0.28 26.351<0.05 FINS（mmol/L）10.49±3.05ab 8.36±2.41a 3.52±0.41 13.261<0.05 HOMA-IR 3.97±0.61ab 2.25±0.34a 1.05±0.26 15.261<0.05 CML（mg/L）76.49±19.35ab 52.31±16.11a 6.35± 2.01 21.351<0.05

2.2 高钙化组与低钙化组血清CML 水平比较 高钙化组、低钙化组血清CML 水平分别为（83.56 ±8.19）、（64.43 ± 6.35）mg/L，钙化积分分别为（6.91± 1.05）、（2.61 ± 1.25）分。高钙化组血清 CML 水平、钙化积分高于低钙化组（P<0.05）。Spearman 秩相关分析结果显示，钙化组血清CML 水平与钙化积分呈正相关（rs=0.597，P<0.05）。

2.3 T2DM 患者颈动脉钙化的影响因素 构建Lo⁃gistic 回归方程，以T2DM 患者颈动脉钙化为因变量（0=否、1=是），BMI（连续性变量）、吸烟史（赋值：0=否、1=是）、合并高血压（赋值：0=否、1=是）、合并高脂血症（赋值：0=否、1=是）、收缩压、TC、FPG、FINS、HOMA-IR、T2DM 病程、使用他汀类药物（赋值：1=是、2=否）、CML 为自变量，逐步法排除无关变量，最终高 TC、HOMA-IR、CML 是 T2DM 患者颈动脉钙化的危险因素（P均<0.01），见表2。校正TC、HOMAIR 后CML 仍为T2DM 患者颈动脉钙化的影响因素（OR=1.953，95%CI：1.842～2.632，P<0.05）。

2.4 血清CML诊断T2DM颈动脉钙化的价值 ROC分析CML 诊断T2DM 颈动脉钙化的最佳截断值为73.49 mg/L，AUC为 0.717（95%CI：0.621～0.813，P<0.05），其灵敏度、特异度、约登指数、阳性预测值、阴性预测值、漏诊率、误诊率、诊断符合率分别为78.26%、82.50%、0.61、91.14%、62.26%、21.74%、17.50%、79.55%。

3 讨论

持续高糖环境下，蛋白质、脂类及核酸等经非酶糖基化，形成结构稳定的糖基化终产物（AGE）。AGE 通过过度氧化应激加速血管平滑肌细胞中的钙沉积［8］。CML 是 AGE 最重要的活性成分之一，通过与细胞膜受体结合而影响巨噬细胞、血管内皮细胞、系膜细胞等功能释放大量促炎因子，加重炎症反应，并导致活性氧合成，诱导氧化应激反应，加重血管粥样硬化进程。现有研究显示，CML 通过干扰细胞内胆固醇反馈调节引起糖尿病肾病［9］，CML 升高与糖尿病患者血管并发症发生有关［10］，血清CML 水平与糖尿病患者脑白质微结构改变和认知功能障碍发生有关［11］。本研究发现，T2DM 患者钙化组CML水平高于无钙化组和对照组，说明CML 在影像学发现血管钙化之前已经出现异常升高，且CML 持续升高反映钙化的发生。进一步观察不同钙化程度患者血清CML水平差异，发现高钙化组血清CML水平高于低钙化组，CML 与钙化积分呈正相关，说明CML持续升高反映动脉钙化的进展。李丽华等［12］发现，随着糖尿病患者血清CML 水平升高胫前动脉斑块内钙化风险增加，与本研究结论一致。回归分析结果显示，高CML 水平是T2DM 患者发生颈动脉钙化的危险因素之一，CML水平每增加1 mg/L，颈动脉钙化风险将提高2.004 倍，校正TC、HOMA-IR 后CML仍与T2DM 患者颈动脉钙化有关，进而证实了CML与T2DM 患者颈动脉钙化的关系。CML 参与T2DM发生颈动脉钙化的机制尚不清楚，可能为糖尿病早期已启动蛋白质非酶糖化反应，诱导机体产生氧化应激，导致CML 产生增多，CML 能诱导单核巨噬细胞分泌生长促进因子，吞噬氧化低密度脂蛋白形成泡沫细胞，通过向内皮下迁移导致血管内皮细胞不断增厚，导致动脉粥样硬化斑块形成［13］。丙酮酸脱氢酶激酶（PDK4）是细胞能量代谢中重要线粒体基质酶，在糖尿病、血管钙化患者中均发现PDK4 过度激活。CML 通过介导活性氧表达，促使PDK4 激活，降低runt 相关转录因子2 表达，导致血管钙化。在CML 诱导的血管钙化过程中，可增加葡萄糖消耗，导致乳酸产生，改变血管平滑肌细胞葡萄糖代谢［8］。

表2 T2DM患者颈动脉钙化影响因素的Logistic回归分析

本研究 ROC 分析结果显示，CML 诊断 T2DM 颈动脉钙化的AUC 为0.717，灵敏度、特异度分别为78.26%、82.50%。提示 CML 可能成为T2DM 颈动脉钙化诊断的新生物学指标，对于血清CML 水平明显升高的T2DM 患者应高度警惕颈动脉钙化的发生，预防心脑血管疾病。回归分析结果显示，除CML 外，高 TC、HOMA-IR 也是 T2DM 患者颈动脉钙化的危险因素，胰岛素抵抗导致血糖难以控制，长期处于高血糖环境下，血液黏滞度增加，血流速度减缓，糖类复合物沉积，致使血管平滑肌钙化；其次高血糖会加重动脉壁AGE 堆积，诱导CML 水平升高，加速血管钙化［14］。血脂代谢异常，血脂水平升高可引起脂质沉积于动脉管壁，引起血管壁增厚，管腔狭窄，血脂在血管壁沉积可破坏血管内皮细胞，释放趋化、黏附分子，趋势单核细胞迁移至内皮层形成巨噬细胞，巨噬细胞吞噬氧化低密度脂蛋白后形成泡沫细胞，形成动脉粥样硬化斑块［15］。提示对于T2DM患者应积极控制血糖，保持血糖稳定状态，合并高脂血症患者应增加他汀类药物，降低血脂水平，以预防心脑血管疾病发生。

综上所述，T2DM 患者血清CML 水平升高，高水平的CML可引起和加重动脉钙化，监测CML水平可为T2DM 患者颈动脉钙化评估提供参考。抑制AGE产生，尤其是CML 可能对逆转颈动脉钙化进程有益，为临床治疗提供新的靶点。