慢性心力衰竭患者血浆外泌体miR-214-3p和miR-184的表达及意义

曹春

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)，是心血管疾病系统的终末阶段[1]。心血管系统疾病致死率很高，所以目前临床上急需新的、有较好价值的生物诊断指标。外泌体miRNA有高度的生物学稳定性，储存在-70℃ 1个月，其基因表达谱仍然具有研究价值[2]，且外泌体miRNA具有耐酸性质。有研究显示，外泌体中miR-194、miR-192在急性心肌梗死后期、心力衰竭早期表达水平明显上升，外泌体miRNA与心力衰竭早期左心室的舒张功能相关，所以外泌体miRNA可能是心力衰竭早期的诊断标志物[3]。另有报道miR-184在心血管疾病、结肠癌疾病、肺癌等疾病中都具有抑制作用[4]。然而，外泌体miR-214-3p、miR-184在心力衰竭中研究报道较少。本研究拟探讨miR-214-3p、miR-184在CHT患者血浆外泌体表达情况，并分析其与CHT的关系，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016至2018年在本院就诊的CHF患者106例(心衰组)，其中男57例，女49例；年龄54～89岁，平均年龄(70.90±11.90)岁；另外选取本院健康体检者127例(对照组)，其中男62例，女65例；年龄53～87岁，平均年龄(68.70±12.80)岁。本研究通过伦理委员会批准，受试者知情同意并签署临床研究协议书，符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 心力衰竭纳入标准：①参照《中国心力衰竭诊断和治疗指南2014》，诊断明确的慢性心力衰竭。②符合纽约心脏协会心功能分级(NYHA心功能分级)，Ⅰ级：体力活动不受限制；Ⅱ级：体力活动轻度受限；Ⅲ级：体力活动明显受限；Ⅳ级：不能从事任何体力活动。

1.2.2 排除标准：伴有肺源性心脏病、风湿性心脏病、严重内分泌疾病、严重肝肾功能异常、严重的感染性疾病、妊娠、血液透析、恶性疾病者。

1.3 仪器与试剂 外泌体抽提试剂盒，美国Invitrogen公司；miRcute miR亲和柱，北京天根生化有限公司；引物，上海生工生物公司；反转录试剂盒、荧光定量试剂盒，日本TaKaRa公司；低速离心机，美国赛默飞世尔公司；-80℃超低温冰箱，上海生工生物公司；荧光定量PCR仪，美国Bio-Rad公司；贝克曼生化分析仪，美国贝克曼库尔特公司；iu22心脏彩色多普勒超声，荷兰飞利浦电子集团。

1.4 研究方法

1.4.1 样品采集与保存:入院治疗CHF患者及健康体检者晨起后，空腹抽静脉血5 ml，装于EDTA-K2抗凝管中，置于4℃、3000×g，半径10 cm，离心5 min，分离血浆。将样品备份保存于-80℃超低温冰箱中。

1.4.2 荧光定量PCR检测血浆外泌体miR-214-3p、miR-184的表达:按照外泌体提取试剂盒指示说明，提取样本血浆中外泌体。使用天根公司miRcute miR亲和柱提取和纯化外泌体小RNA。将纯化好的样品miRNA装于200 μl无RNA酶EP管中，用15 μl无RNA酶ddH2O溶解。备份保存于-80℃超低温冰箱中。分光光度计检测产物的OD260/OD280，取OD260/OD280值介于1.9～2.1进行反转录。miR-214-3p、miR-184及内参基因U6引物序列由上海生工合成。将得到的cDNA反应液作为模板，以U6作为内参进行荧光定量PCR扩增反应。qRT-PCR反应体系20 μl：2×UltraSYBR Mixture 10.0 μl，Template cDNA(50 ng/μl)2.0 μl，Forward Primer 1.0 μl，Reverse Primer 1.0 μl，ddH2O 6.0 μl。反应条件：95℃，3 min；95℃，25 s；62℃，20 s；72℃，15 s；35个循环。对miR-214-3p、miR-184相对表达量用2-ΔΔCT法计算。见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4.3 相关临床指标检测:①超声心动图:检测所有受试者，进行心脏超声检测，检测项目包括左心室舒张末期内径(LVEDD)、左心室短轴缩短率(FS)、左心室射血分数(LVEF)等。②血浆脑钠肽(BNP)水平:所有受试者清晨空腹抽静脉血6 ml，室温静置35 min，于4℃、3000×g离心10 min，分离血清，使用贝克曼生化分析仪测定血浆BNP水平。

2 结果

2.1 2组一般资料比较 与对照组比较，心衰组年龄、性别比、糖尿病、高血压比例差异无统计学意义(P>0.05)，心衰组FS、LVEF水平低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，心衰组BNP、LVEDD、显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 2组临床资料比较

2.2 2组血浆外泌体中miR-214-3p、miR-184表达 与对照组比较，心衰组患者血浆外泌体中miR-184表达水平显著下降，差异有统计学意义(P<0.05)，miR-214-3p表达水平显著上升，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 CHF患者血浆外泌体中miR-214-3p、miR-184表达水平

2.3 不同心功能分级患者血浆外泌体miR-214-3p、miR-184表达水平比较 与对照组比较，Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级不同心功能分级患者血浆外泌体miR-214-3p表达水平依次升高，miR-184表达水平依次降低，两两比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 不同心功能分级患者miR-214-3p、miR-184表达水平

2.4 不同心功能分级患者BNP、LVEDD、FS、LVEF水平比较 与对照组比较，Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级不同心功能分级患者LVEDD、血浆BNP水平依次升高，两两比较差异有统计学意义(P<0.05)，FS、LVEF水平依次降低(P<0.05)。见表5。

表5 4组患者BNP、LVEDD、FS、LVEF水平比较

2.5 Pearson相关分析 Pearson相关分析显示，CHF组血浆外泌体miR-214-3p表达水平与BNP、LVEDD呈正相关(P<0.05)，与LVEF呈负相关(P<0.05)；miR-184表达水平与BNP、LVEDD呈负相关(P<0.05)，与LVEF呈正相关(P<0.05)。见表6。

表6 血浆外泌体中miR-214-3p、miR-184水平与临床指标相关性分析

3 讨论

CHF是各种心血管疾病发展的终末阶段。研究表明，miRNA在糖尿病性心肌病的发生及脂肪分化中均具有重要作用[5,6],因此研究miRNA表达水平对临床CHF早期诊断意义重大。

BNP与心功能有密切关系，邸玉青[7]证实BNP在心力衰竭患者血浆中浓度随心功能等级递增(NYHA心功能分级Ⅰ～Ⅳ)逐渐增加。本研究发现，BNP在CHF血浆中水平显著升高。BNP的分泌主要与左心室壁张力有关，张惠敏[8]发现心力衰竭患者LVEF的降低程度与BNP分泌显著相关，外周血血浆BNP水平可反映LVEF损害程度。王小燕等[9]发现在NYHA Ⅲ、Ⅳ级CHF患者LVEDD水平显著高于NYHA Ⅰ、Ⅱ级患者，FS水平显著低于Ⅰ、Ⅱ级患者。本研究发现Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级不同心功能分级CHF患者LVEF、FS水平呈下降趋势，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级不同心功能分级CHF患者LVEDD水平呈递增趋势，提示CHF患者心室均存在不同程度损伤。

Zhou等[10]研究发现miR-184通过与lncRNA UCA1竞争性结合靶位点，促进心脏肥大疾病发生，且miR-184表达水平与心脏肥大患者心肌细胞中的lncRNA UCA1表达呈负相关。Huang等[11]利用大鼠研究实验发现miR-184在紫绀型先天性心脏病缺氧性心肌细胞中表达水平下调，因此可能减少心肌细胞的增殖和诱导心肌细胞的凋亡。在临床上，Gurha等[12]研究发现miR-184在幼儿胚胎心脏中表达最高，在成人心肌细胞中最低。本研究发现，miR-184在CHF组血浆外泌体中表达水平显著下降，提示miR-184可能参与CHF疾病发生。miR-184表达水平随CHFⅡ级、Ⅲ级、Ⅳ级不同心功能分级增加而减少，进一步相关性分析显示，miR-184表达水平与BNP、LVEDD存在负相关性，与LVEF存在正相关性，提示miR-184可能与CHF患者心功能损伤程度有关。

有研究显示肿瘤细胞的发育、分化及乳腺癌、胰腺癌等疾病与miRNA-214表达异常有密切关系，可作为肿瘤诊断的分子标志物[13]。Onrat等[14]发现，miR-214-3p在缺血性扩张型心肌病和特发性扩张型心肌病血清中表达水平呈升高趋势。Yan等[15]发现miR-214-3p在心脏衰竭患者成人心脏心肌细胞中表达水平较胎儿时期低。本研究显示miR-214-3p在心衰组血浆外泌体中表达水平显著上升，且miR-214-3p表达水平随CHFⅡ、Ⅲ、Ⅳ级不同心功能分级增加而增加。相关性分析显示，miR-214-3p表达水平与BNP、LVEDD呈正相关，与LVEF呈负相关，提示miR-214-3p与CHF患者心功能有关，可能参与调节CHF发生发展。

综上所述，miR-184在CHF患者血浆外泌体呈低表达，miR-214-3p呈高表达，与患者心功能有关，可能参与CHF疾病发生发展。本研究超声心动图检查结果会受到仪器的敏感度、检查者的技术等影响，患者心功能等级划分是由临床医师执行，二者均存在一定的不足，miR-184、miR-214-3p成为生物学标志物尚需更多临床研究。