两段式发酵工艺中的糖化过程

常玉广，曹晶晶

(南京晓庄学院 环境科学学院，江苏 南京 211171)

0 引言

木质纤维素是价格低廉的可再生资源[1]，可作为生产生物絮凝剂的底物碳源，降低生物絮凝剂的生产成本，具有一定的可行性和开发潜力.

研究表明[2]，秸秆类纤维素经过生物降解，部分葡萄糖等小分子物质被释放出来，成为可被絮凝菌利用的最适碳源.本实验在前期研究的基础上[3-5]，研究两段式发酵工艺中的糖化过程，糖化过程中产生的还原糖被絮凝菌利用，生成生物絮凝剂.

1 实验部分

1.1 实验材料

纤维素菌HIT-3来源于土壤中，为木糖无色杆菌反硝化亚种(Achromobacterxylosoxidansdenitrificans)，该菌株具有较强的降解纤维素的能力；絮凝菌F2主要来源于含油废水处理单元曝气池中的水样，芽孢杆菌属(Bacillussp.)，两例菌均为哈尔滨工业大学环境生物技术实验室开发[6].

纤维素的原料：稻草(将稻草进行碱液浸泡、清洗、烘干、粉碎、过筛、灭菌)，用于两段发酵工艺中的第一段纤维素高效糖化阶段的底物碳源.

1.2 实验方法

1.2.1 两段式发酵工艺

图1 两段式发酵工艺流程

第一段发酵工艺(纤维素高效糖化)：以碱液处理过的稻草(20 g/L)为碳源，配制纤维素培养基，灭菌后装入发酵罐中，并将高效纤维素降解菌群(HIT-3)种子发酵液投入发酵罐中，完成纤维素的高效糖化过程(生成糖化液)；第二段发酵工艺(糖化液制取生物絮凝剂)：将高效产絮菌(F2)种子发酵液投入纤维素糖化液中，制备生物絮凝剂.其工艺流程如图1所示.

1.2.2 絮凝试验

絮凝试验效果采用絮凝率进行表征.取5 g高岭土(化学纯，平均粒度为4.5 μm)加至1000 mL的烧杯中，然后依次加入自来水1000 mL，10%的CaCl2溶液1.0 mL和10 mL发酵液(第二段发酵产物)，并且调节溶液pH值至7.2，之后将烧杯溶液放在搅拌仪上搅拌(快搅，慢搅)使之充分混合，静置20 min后于波长550 nm处测定吸光度(B),以蒸馏水代替培养液作对照空白，于波长550 nm处测定吸光度(A),絮凝率F来表示絮凝活性[7]，见式(1).

F=(B-A)/B×100%

(1)

1.2.3 分析方法

分别取一定量的预处理后的纤维素、第一段发酵工艺中的纤维素高效糖化液的有效成分、第二段发酵中的絮凝剂发酵液，采用3,5-二硝基水杨酸 (DNS)法测定水解液中总还原糖浓度(CTRS)[8]，从而计算还原糖得率TRS[9]，见式(2)，其中m1为碱处理的纤维素质量.

TRS=(CTRS×30)/m1×100%

(2)

2 结果与讨论

2.1 纤维素结构变化

利用木质素能够溶于碱性溶液的特点，用碱液处理稻草，将稻草中的木质素溶解，纤维素的形态发生变化.图2A是未经任何物质处理的原稻草的显微镜下结构，图2B为稻草经碱液处理后的显微镜下结构，从图中可以看出木质素发生了一定程度的溶解，未被溶解的纤维素结构变松散，有利于纤维素被纤维素降解菌生物降解，降解的产物主要是含碳物质，替代第二段发酵工艺中碳源的投入.在降解过程中还有部分纤维素未被降解，以微小颗粒存在于发酵底物中，在絮凝过程中以胶体颗粒状态与悬浮颗粒发生吸附、架桥和网捕絮凝行为，参与絮凝反应过程，减少絮凝剂的投入量.

结构变松散的纤维素被纤维素降解菌所降解，表现在将长链状纤维素(图2C)降解成微小颗粒(图2D).纤维素被认为是葡萄糖单体组成，是由许多葡萄糖分子以糖苷键相连而成直链.当纤维素长链断开后，大部分葡萄糖以单个个体的形式存在，这些葡萄糖作为第二段发酵工艺中的絮凝菌的代谢底物的碳源，此段工艺运行即纤维素发酵的糖化过程.

图2 纤维素结构变化

图3 不同发酵阶段发酵液的葡萄糖得率

2.2 纤维素水解糖化

取纤维素糖化段发酵液和絮凝段发酵液，未投加纤维素降解菌和絮凝菌的培养基作为空白对照，测定还原糖产率，如图 3所示.在同样的培养条件下，第一段还原糖得率12.1%，远远高于空白组和第二段工艺的还原糖得率，这是因为第一段工艺中的葡萄糖主要来自于稻草纤维素的生物降解，而且在稻草的预处理过程中纤维素降解也会产生少量的葡萄糖[10]，纤维素降解菌降解纤维素生成的葡萄糖是第二段絮凝发酵的关键底物，因此，第一段糖化过程产生的还原糖能够满足絮凝菌的利用.第二段絮凝发酵液中的还原糖得率有所降低，主要原因是絮凝菌在发酵过程中消耗了以葡萄糖为主的糖类物质，因此纤维素发酵产生的糖类物质大部分供絮凝菌所利用，还原糖得率降低.另一个可能原因是发酵液中发生了产物抑制效应，抑制作用阻遏了纤维素降解菌对底物的利用，致使纤维素降解菌利用发酵液中的还原糖以维持自身生长繁殖需要[11]，消耗了一部分还原糖.同时也要考虑纤维素降解菌和絮凝菌生长条件的差异，纤维素降解菌在利用糖后会降低发酵液的pH值，而絮凝菌更适宜在中性或弱碱性条件下生长，因此，在两段式发酵过程中需实时监控反应底物的pH值，维持发酵罐中酸碱平衡，促使反应顺利进行.

图4 两种生物絮凝剂的絮凝效果

2.3 絮凝效果测定

传统絮凝剂以葡萄糖为碳源，两段式发酵生成絮凝剂则是以纤维素糖化液为碳源.比较两种底物碳源产生的絮凝剂的絮凝效果(图4).

传统絮凝剂在发酵12 h时絮凝效果即可达到絮凝率92.5%，在24 h和48 h时絮凝率分别为86.3%和84.0%，随着发酵时间的延长，生成的生物絮凝剂的絮凝率有逐渐下降趋势，分析其原因，主要是葡萄糖易被絮凝菌F2利用，当达到碳源的利用率最高时，即絮凝剂生成的量也最多，絮凝剂的有效成分处于最佳状态，絮凝率也就最大.随着时间的推移，碳源逐渐降低，絮凝菌则会优先满足自身生长需求，为了生存会继续消耗碳源，产生的絮凝剂有效成分中的糖类和蛋白类物质会慢慢减少，絮凝剂的絮凝效果也会随之降低.

两段式发酵生成的絮凝剂，其絮凝效果在48 h处达到峰值.因为纤维素在纤维素降解菌的作用下，是缓慢降解，因此，仍然有部分在持续糖化，也就是说絮凝菌在第二段发酵中利用的糖类是由纤维素缓释产生的，絮凝剂的絮凝效果是持续上升的.另外一个原因是当絮凝菌加入纤维素所降解的发酵液中时，纤维素降解菌仍处于一个生长旺盛阶段，并不能排除两种菌在同一生长环境中所产生的协同作用，而促使纤维素降解菌继续产生有机碳，絮凝菌得到大量的可利用碳源，提高了代谢速度，同时代谢产物也相应增加，生物絮凝剂的有效成分也随之增加[12].48 h之后，絮凝剂的絮凝率有所下降，这是因为纤维素降解产生的糖类达到一定限值之后，供应絮凝菌的糖类减少，产生的絮凝剂的有效成分也在慢慢减少，絮凝剂的絮凝效果则随之降低.

3 结论

在两段式发酵工艺中，糖化阶段产物的质量是生物絮凝剂高效的前提条件.第一阶段糖化过程中，还原糖得率12.1%，第二阶段产生的絮凝剂的絮凝率为82.1%.

两段式发酵是利用廉价稻草作为底物碳源，生产高效生物絮凝剂的一种工艺.糖化产生的还原糖被絮凝剂利用，减少了絮凝剂生成中的碳源投加量，降低了絮凝剂的生产成本，且絮凝效果好.也进一步验证了纤维素降解菌和絮凝菌在相同培养环境下能够共同生长，它们之间通过协调作用出现了生态位的分离，避免了种群间激烈的竞争，共同完成两段发酵过程.本实验所选的纤维素材料，为后期应用天然秸秆类纤维素等物进行发酵生产奠定了基础.

致 谢 特别感谢学姐吴波的协助完成.