基于高通量测序分析玉米浸泡副产物中细菌群落结构和多样性

张守梅 郭玉秋 张娜娜 李克文 孙桂莲 龚魁杰 王兴亚 刘开昌

摘要：为了更加全面了解玉米浸泡副产物中微生物多样性，比较其中细菌群落结构，利用高通量测序技术，对玉米浸泡液、玉米浆及玉米喷浆粉中细菌16SrRNAV4区进行测序，进而分析细菌多样性和群落组成结构。结果表明：共获得190069条有效数据，通过聚类获得352个OTUs，隶属于12门、68纲、183属。α多样性分析结果表明，玉米喷浆粉中Shannon指数明显高于玉米浸泡液和玉米浆。微生物群落组成分析发现，在门水平上，厚壁菌门（Firmicutes）是玉米浸泡液、玉米浆及玉米喷浆粉的共同优势菌门;在属水平上，乳杆菌属（Lactobacillus）为玉米浸泡液、玉米浆及玉米喷浆粉的优势属;在种水平上，玉米浸泡液中优势菌为耐酸乳杆菌（L.acetotolerans），玉米浆及玉米喷浆粉中优势菌为解淀粉乳杆菌（L.amylolyticus）。

关键词：玉米浸泡副产物;高通量测序;细菌;群落结构;多样性

中图分类号：S513：Q939.1 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2021）12-0143-06

玉米是我国主要粮食和饲料作物，随着玉米工业化用途的增加，出现了更多的加工副产品，副产品以废水的形式直接排放，降低了附加值，并且加剧了环境的污染。近年来，玉米深加工副产品的综合利用引起了人们广泛关注[1]。玉米浸泡液是湿法生产淀粉的副产物之一，玉米经亚硫酸浸泡后，颜色为黄色透明，pH值为3.0左右，其中含有大量的蛋白质、糖类、维生素等物质。浸泡液浓缩即制成玉米浆[2-4]。玉米浆喷到玉米皮上，干燥后制成玉米喷浆粉，可以作为饲料原料出售[1]，或者用于微生物发酵行业[5-10]。另外，可以直接从玉米浸泡液中提取蛋白肽、黄色素等物质[11-13]。

玉米浸泡液会造成某些特定微生物群体的大量繁殖，主要包括乳杆菌、短粗杆菌、芽孢杆菌、酵母菌等[14]，这些微生物与人和动物的健康密切相关。在玉米浸泡过程中若有乳酸菌和酵母菌大量生长，则可以提高玉米浆的质量;若有腐败性细菌则降低玉米浆的质量。过去对微生物的研究主要采用直接镜检和传统分离培养技术，直接镜检优点是快速得到结果，缺点是无法确定具体的种类，同時对检验者知识储备要求较高。利用传统的分离培养方法操作简单且直接，还可以获得具有利用价值的菌株，是分析微生物群落结构多样性最基本的方法。但是，该方法工作量大，且仅能培养出极少量微生物，具有很大的局限性，许多微生物在普通培养基上不能生长，不能准确反映环境中总体微生物群落结构特征。随着现代分子技术的发展，人们开始利用非培养技术研究复杂环境中的微生物群落。高通量测序技术作为新一代全新的测序技术，能够快速、全面分析不同样本的群落结构，已被广泛应用到传统发酵食品、酿酒、土壤、粪便、肠道、水体中等微生物多样性的研究[15-23]。

本研究从玉米浸泡液、玉米浆及玉米喷浆粉中提取细菌基因组DNA，对16SrRNAV4区进行高通量测序，获得不同处理阶段微生物组成和多样性，为玉米副产物进一步开发利用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米浸泡液副产物（玉米浸泡液、玉米浆及玉米喷浆粉）来源于西王集团。

DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（德国Qiagen公司）;TruSeq DNAPCRFreeSamplePreparationKit建库试剂盒（美国Illumina公司）;PhusionDNA聚合酶（美国NewEnglandBiolabs公司）

1.2 仪器设备

PCR仪（力康生物医疗科技有限公司）;台式高速冷冻离心机（美国ThermoFisherScientific公司）;恒温金属浴（杭州米欧仪器有限公司）;NUGenius凝胶成像系统（GeneCompanyLimited）;XW-80A旋涡混合仪（宁波新芝生物科技有限公司）;水平电泳仪（Bio-Rad公司）;分析天平（德国赛多利斯公司）;IlluminaNovaSeq6000（美国Illumina公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 样品采集 玉米浸泡液、玉米浆：将采集样品的玻璃瓶经121℃高压灭菌，装入无菌自封袋。取样时，佩戴一次性无菌手套，靠近出样口时打开瓶盖接黄浆水，之后拧紧瓶盖，装入自封袋中带回实验室，一部分于4℃冰箱暂存，一部分于-20℃冰箱保存。

玉米喷浆粉：利用无菌铲取出，放于无菌塑料袋中，带回实验室后一部分于4℃冰箱暂存，一部分于-20℃冰箱保存。

1.3.2 样品总DNA的提取及PCR扩增 按照试剂盒说明书对样品基因组DNA进行提取，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度，取适量样品DNA于离心管中，使用无菌水稀释至100ng/μL。

以稀释后的基因组DNA 为模板，选择细菌16srRNAV4区进行PCR扩增。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测，并利用凝胶回收试剂盒回收。

PCR 扩增引物：515F（5′GTGYCAGCMGCCGCGGTAA3′）和806R（5′GGACTACNVGGGTWTCTAA3′）;PCR体系：10×Buffer2μL，dNTP2μL，正反引物各0.8μL，PhusionDNA聚合酶0.2μL，模板DNA1μL，ddH2O补足至20μL。PCR扩增条件：95℃预变性5min;95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环;72℃延伸10min;4℃保存。

1.3.3 高通量测序 使用TruSeq DNAPCRFreeSamplePreparationKit建库试剂盒进行文库构建，构建好的文库经Qubit和qPCR定量，文库合格后，使用NovaSeq6000进行上机测序（北京诺禾致源科技股份有限公司）。

1.3.4 数据处理 根据Barcode序列和PCR扩增引物序列从下机数据中拆分出各样本数据，截去Barcode和引物序列后使用FLASH（V1.2.7，http：//ccb.jhu.edu/software/FLASH/）对每个样本的Reads进行拼接，得到的拼接序列为原始Tags数据（RawTags）;拼接得到的RawTags经过严格的过滤处理[19]得到高质量的Tags数据（CleanTags）。参照Qiime（V1.9.1，http：//qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.html）Tags质量控制流程，得到最终的有效数据（EffectiveTags）。利用Uparse软件对所有样本的有效数据进行聚类，默认以97%的一致性将序列聚类成为OTUs（OperationalTaxonomicUnit）的代表序列。

对OTUs序列进行物种注释，用Mothur方法比对数据库进行物种注释分析，同时计算该OTUs在各样本中的相对含量。使用Qiime软件对样品的多样性指数进行分析。

2 结果与分析

2.1 细菌多样性分析

样品高通量测序后共获得序列312240条，经过对原始数据拼接、过滤，共得到190069条有效数据，通过聚类获得352个OTUs。为了直观表现出玉米浸泡液（N1）、玉米漿（N2）、玉米喷浆粉（N3）共有OTUs和特有OTUs，对获得的OTUs进行了统计和比较分析。由图1可知，玉米浸泡液、玉米浆、玉米喷浆粉共有OTUs数量为50个，玉米浸泡液中特有OTUs为52个，玉米浆中特有OTUs为33个，玉米喷浆粉中特有OTUs为128个，表明玉米喷浆粉中微生物群落较玉米浸泡液和玉米浆丰富。

α多样性分析反映了单个样品内物种的丰富度和多样性。样本的覆盖率表明测序的数据能够覆盖目前状态下样品中细菌的种类，由表1可知，样品中覆盖率均为1，说明样本中被测出的概率较高，能真实反映样本中细菌物种丰度及多样性[24]。OTUs数可以代表样品物种的丰度[16]，ACE指数是用来估计群落中OTUs数目的指数，玉米喷浆粉的OTUs数量最多，ACE指数最高，其次是玉米浸泡液，因此玉米浸泡液副产物由浓缩到制粉过程中，微生物丰度发生了先降低后增加的变化。Chao1指数可估计样品群落中包含的物种总数，值越大表明物种总数越多，由浸泡液到制成喷浆粉的过程物种总数发生了先降低后增加的变化。Shannon指数表示样品中群落多样性，指数越大群落多样性越高，多样性由高到低依次为玉米喷浆粉、玉米浆、玉米浸泡液。Simpson指数反映了样品群落中物种均匀度，玉米喷浆粉中的均匀度最高。

2.2 细菌群落结构差异分析

2.2.1 门水平下玉米浸泡液副产物中细菌群落结构分析 在门水平下共鉴定出12个门类细菌，图2显示了玉米浸泡液（N1）、玉米浆（N2）、玉米喷浆粉（N3）中丰富度前10的物种，其余的合并为others。优势细菌门是厚壁菌门（Firmicutes），从浓缩到制粉的过程中，厚壁菌门的相对丰度逐渐减少，变形菌门（Proteobacteria）和蓝菌门（Cyanobacteria）的相对丰度增加。变形菌门在玉米浸泡液、玉米浆、玉米喷浆粉中相对丰度分别为1.1%、14.2%和28.0%，呈逐渐上升趋势，原因可能为变形菌门中的细菌为好氧型，不能适应玉米浸泡液高温、高酸、缺氧的极端环境;玉米喷浆粉中营养物质丰富，有氧的环境促进了变形菌门的生长。

2.2.2 属水平下玉米浸泡液副产物中的细菌群落结构分析 在属水平下共检测出183个属的细菌，图3显示属级丰富度前30的细菌，其他的合并为others，图4显示丰富度前100属的细菌系统发育分析。由图3、图4可知，玉米浸泡液、玉米浆、玉米喷浆粉的微生物主要为厚壁菌门（Firmicutes）下的乳杆菌属（Lactobacillus），其相对丰度分别为97%、83%、23%。由浸泡液到喷浆粉的过程中许多好氧型细菌增加，如假单胞菌属（Pseudomonas）、沙雷氏菌属（Serratia）等。玉米浸泡液中微生物群落结构是一个动态变化的过程，初期乳杆菌大量繁殖，产生乳酸，抑制了异种微生物生长，后期乳酸对自身起到了限制作用;在玉米浆中，除乳杆菌外的其他细菌生长，相对丰度增加;由玉米浆到喷浆粉，许多好氧菌迅速增加，微生物丰富度增加。

2.2.3 种水平下玉米浸泡液副产物中细菌群落结构分析 鉴定到种的细菌有101个，隶属于乳杆菌属的细菌有耐酸乳杆菌（L.acetotolerans）、解淀粉乳杆菌（L.amylolyticus），还包括少量的嗜淀粉乳杆菌（L.amylovorus）、开菲尔基质乳杆菌（L.kefiranofacie，图5）。玉米浸泡液的优势菌为耐酸乳杆菌，相对丰度为80.6%。玉米浆和玉米喷浆粉优势菌为解淀粉乳杆菌，相对丰度分别为82.5%、17.0%。玉米喷浆粉中还存在粘质沙雷氏杆菌（Serratiamarcescens）、莓实假单胞菌（P.fragi）、耐热芽孢杆菌（Bacillussporothermodurans），这些有害细菌不仅具有食物致腐能力，还是条件致病菌，在机体免疫力下降的情况下引起肺部、尿路感染甚至败血症。芽孢杆菌革兰氏染色阳性，需氧或兼性厌氧，具有抵御不良环境的能力。许多芽孢杆菌具有解磷、固氮、广谱性抗菌、高产淀粉酶、蛋白酶等功能，在农业生产、食品加工、工业生产、医疗等方面起到了重要作用。但是也有一些芽孢杆菌具有致病性，产生耐热毒素，引起食物中毒;因其独特的耐高温特性，普通的热处理很难将其消灭，给食品质量安全造成隐患。芽孢杆菌在玉米浸泡液和玉米浆中主要以芽孢的形式存在，常规的提取方法很难获得高质量的DNA用于PCR反应，因此，高通量测序显示玉米浸泡液和玉米浆中芽孢杆菌数量极少。

在玉米浸泡液和玉米浆中的细菌主要为耐酸乳杆菌和解淀粉乳杆菌，其他微生物相对丰度较低。分析原因：其一是因为相对缺氧的、酸性较高的液体环境适合耐酸乳杆菌的生长;其二，许多研究发现乳杆菌可以产生细菌素等拮抗物质，还可以通过与其它微生物竞争底物等途径影响其它微生物的生长[25-28]。

3 讨论与结论

玉米浸泡液是微生物生长、繁殖代谢的场所，本研究通过高通量测序技术对玉米浸泡液、玉米浆和玉米喷浆粉的细菌群落结构和多样性进行分析，揭示了玉米副产物在不同加工过程中微生物群落结构变化。由于浸泡液含丰富的营养物质，酸性环境较强，因此乳杆菌丰富，生长旺盛。浓缩成玉米浆后，随着时间的增加，乳杆菌的生长受到抑制，其他种类的细菌相对增多。α多样性分析表明，玉米喷浆粉中OUTs数量最多，群落结构中丰富度、多样性、均匀度最高。该研究结果可为玉米副产物的保存、开发利用提供借鉴和参考。

本研究表明：玉米浸泡液、玉米浆和玉米喷浆粉的优势菌门是厚壁菌门，且厚壁菌门的相对丰度依次减少。变形菌门在玉米浸泡液、玉米浆、玉米喷浆粉中逐渐增多。在属水平上，乳杆菌属为玉米浸泡液、玉米浆、玉米喷浆粉的优势菌属，且其相对丰度依次减少。刘庆艾等[29]研究了H2O2玉米浸泡工艺及其浸泡液中菌群结构的变化，结果表明，浸泡初期细菌结构组成较为丰富，一段时间后，Lactobacillaceae生长繁殖成为优势菌种并伴随OTUs水平的降低，浸泡末期Lactobacillaceae进入衰亡期，其他细菌数量明显增加。金渭武等[30]分析了逆流浸泡过程中微生物的变化，发现整个浸泡过程中，Lactobacillaceae占绝对优势并在浸泡前期发酵产生大量乳酸。乳杆菌作为环境中的优势菌种，能够消耗有限的营养物质，与病原菌竞争生存空间从而抑制病原菌的生长繁殖[31];另外，在生长过程中分泌的抗菌素物质可抑制其他病原菌生长，产生的乳酸降低了环境中的pH值也能抑制其他病原菌的生长繁殖[32]。因此玉米浸泡液和玉米浆更有利于玉米浸泡液副产物的储存和质量保证。