基因拷贝数对重组毕赤酵母的牛乳铁蛋白功能片段表达及细胞存活率的影响

钱晓芬，吴涛，赵理想，孙杰，汪钊，魏春

(浙江工业大学 生物工程学院，浙江 杭州，310014)

牛乳铁蛋白(bovine lactoferrin, Blf)是一种非血红素铁结合蛋白，由689个氨基酸组成的单一多肽链，分子质量为77 kDa，具有广谱的抗菌、抗真菌、抗病毒、抗肿瘤及参与免疫调节等多种生物学活性[1-5]，在食品添加剂、饲料添加剂、医药行业中已有广泛的应用[6-9]。牛乳铁蛋白目前主要从牛乳中提取制得，生产成本高。重组微生物发酵生产牛乳铁蛋白是一种降低牛乳铁蛋白生产成本的极具潜力的方法。毕赤酵母易于高密度发酵培养，AOX1启动子强劲，且具有真核细胞翻译后折叠修饰、加工、糖基化等功能，是表达牛乳铁蛋白的优良宿主[10-16]。本实验室已经构建分泌表达牛乳铁蛋白功能片段(包括2个功能结构域的1～333氨基酸序列，bovine lactoferrin functional fragment, BlfFf)的重组毕赤酵母，但表达量有待提高[17]。增加基因拷贝数是提高重组蛋白表达的最有效手段之一，而核糖体rDNA非转录基因间隔区NTS(non-transcribed spacer)同源整合以及PTVA(posttransformational vector amplification)法是获得多拷贝重组菌株的常用手段[18-20]。HAC1基因编码的Hac1p蛋白是酵母内质网中未折叠蛋白响应(unfolded protein response, UPR)机制的激活因子，因而多拷贝HAC1基因也是提高表达量的有效方法[21-23]。因此本研究在先前工作基础上，进行HAC1等辅助表达基因的导入及多拷贝重组菌的构建及筛选，并借助流式细胞术检测酵母存活率[24-25]，以研究基因多拷贝的影响和提高BlfFf表达量。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒

宿主菌PichiapastorisGS115，本实验室保藏菌株；BlfFfG01重组菌及质粒pPICZαA -P0547-Kex2-2A-HAC1由本实验室构建[17, 21]；E.coliDH5α感受态细胞,唯地生物。……