2013-2018年福建省部分规模化猪场猪伪狂犬病病毒野毒感染的流行病学调查

林日丹，夏梁峰，尹会方，费世港，范克伟,，黄思琼，李晓华,，杨小燕,，戴爱玲,

（1.龙岩学院生命科学学院，龙岩364000；2.福建省生猪疫病防控工程技术研究中心，龙岩364000）

伪狂犬病（Pseudorabies，PR）是由伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的一种急性高度接触性B类传染病。主要引起种猪繁殖障碍；新生仔猪出现典型神经症状或顽固性腹泻，死亡率可达90%～100%；育肥猪出现呼吸道或者增重减慢的症状等[1]。PRV感染会引起机体免疫抑制，猪体可长期带毒和排毒，容易并发感染其他疾病[2]。该病最早发生于1813年美国1头表现为极度瘙痒最后死亡的病牛[3]。我国自1947年初次报道伪狂犬病以来，已经有31个省市相继报道，且近年该病在我国的流行呈上升趋势[4]。福建省于1962年12月长泰县的黄牛中初次发现该病，1965年1月在该县的发病仔猪中发现[5]。猪伪狂犬病经过疫苗免疫、净化、扑杀等措施可取得较为明显的控制效果[6]。自2011年我国华北地区出现免疫猪场猪伪狂犬病病毒野毒阴性猪群快速感染转阳后，在全国其他多个省份也陆续发生该现象[7]。与此同时，2011年从5个省14个暴发PRV猪场中采集样本中均分离到了PRV流行毒株且已发生变异，致病性比以往分离毒株更强[8]。PRV变异毒株的感染和流行给我国养猪业带来了巨大的经济损失，其防控与净化形势非常严峻。

为了掌握2013-2018年福建省西南地区规模化猪场PRV野毒感染状况，本实验室对陆续收集和采集于该地区疑似发病猪群组织样品及猪血清样品进行PRV野毒感染病原学、血清学检测。

1 材料与方法

1.1 样品来源 调查样品：2013-2018年采自龙岩市的新罗区、永定县、武平县、漳平县、上杭县、长汀县、连城县及泉州市、漳州市等区域787个规模化猪场，疑似感染猪伪狂犬病的组织样品共计1320份，其中包括流产的死胎149份、产房仔猪（0～30日龄）443份、保育猪（30～70日龄）585份、育肥猪（70～180日龄）69份（部分样品猪群背景信息不详，未列入统计分析），送检病例组织样品的猪场均有免疫PRV-gE基因缺失弱毒疫苗。血清样品包括种猪46 791份（包括能繁母猪、成年公猪）、后备猪8109份（180日龄以后至配种前）、哺乳小猪2854份（0～30日龄）、保育猪5447份（30～70日龄）、生长育肥猪4459份（70～180日龄），共计3041场次的猪场67 660份血清，送检血清样品猪场均有免疫PRV-gE缺失疫苗。

1.2 主要试剂 DL2000 DNA marker、LATaqDNA聚合酶、2×GC Buffer I、dNTP、MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit均购自宝生物工程（大连）有限公司；PRV-gE抗体检测试剂盒（Pseudorabies VirusgE Antibody TestKit）购自北京爱德士生物科技公司。

1.3 引物设计与合成 根据PRV全基因组序列（GenBank登录号：NC_006151）设计了针对PRV gE基因的特异性鉴定引物，gE-JD-F：5'-GCGCTG GGCTCCTTCGTGAT-3'，gE-JD-R：5'-CGCCA TAGTTGGGTCCATTCGT-3'，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，扩增片段大小为400 bp。

1.4 病毒DNA的提取 取疑似发病猪的各组织脏器，根据MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit说明书提取各组织脏器中的PRV DNA。

1.5 PCR检测 利用上述鉴定引物扩增PRV gE基因片段。PCR反应体系（25 μL）：DNA模板2 μL，2×GC Buffer I 12.5 μL，dNTP 4 μL，上、下游引物各1 μL，LATaqDNA聚合酶0.25 μL，用ddH2O补至25 μL。反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，64℃退火50 s，72℃延伸1 min，共35个循环；72℃延伸10 min。

1.6 血清抗体检测 对猪血清样品严格按照PRV gE试剂盒说明书进行PRV ELISA-gE抗体检测。

2 结果

2.1 猪组织样品伪狂犬病病毒野毒感染病原学检测结果

2.1.1 不同年份猪组织样品PRV野毒感染PCR检测结果 2013-2018年采集的疑似病例组织样品的猪伪狂犬病病毒野毒PCR检测结果见表1。结果显示，阳性猪场占比为52.60%（414/787），核酸阳性率为50.83%（671/1320）。2013-2018年阳性猪场比例在2014年出现明显上升，由2013年的59.38%上升至79.63%，2014年和2015年阳性猪场比例维持在79.63%和76.97%，2016年后阳性猪场比例开始有所下降，由41.30%下降至27.14%。核酸阳性样品的变化趋势与阳性猪场比例一致，分别为55.45%、82.56%、68.03%、37.37%、26.11%、27.32%。2013-2018年采集的疑似病例组织样品的PRV野毒PCR检测结果表明，2014-2015年是福建西南规模化猪场PRV野毒感染最严重时期。

表1 不同年份猪组织样品PRV野毒感染PCR检测结果Table 1 The detection results of PRV gE PCR in different years

2.1.2 不同年龄段猪组织样品PRV野毒感染PCR检测结果 对2013-2018年送检的疑似病例组织样品按不同年龄段进行分类统计，结果见表2（部分样品猪群背景信息不详，未列入统计分析）。结果显示，流产死胎、产房仔猪、保育猪、育肥猪的疑似病例组织样品检出PRV野毒核酸阳性率分别为42.28%、46.05%、51.11%、47.83%，且各年份不同年龄段的猪均有感染PRV野毒，其中，2014-2015年不同年龄段猪组织样品PRV野毒阳性率较高（55.17%～83.18%），2016-2018年不同年龄段猪组织样品PRV野毒阳性率在18.84%～41.67%。表明2014-2015年福建省西南地区规模化猪场PR疫情比较严重，2016-2018年猪场不同年龄段发病猪PRV野毒带毒率仍较高。

表2 不同年龄段猪组织样品PRV野毒感染PCR检测结果Table 2 The detection results of PRV gE PCR in different herds

2.2 猪血清样品伪狂犬病病毒野毒感染血清学检测结果

2.2.1 不同年份猪血清样品PRV野毒感染的血清学检测结果 2013-2018年，送检的67 660份猪血清样品PRV野毒抗体（gE抗体）检测结果见表3。结果显示，调查的福建省部分猪场的场阳性率为61.13%，猪血清样品PRV野毒抗体总阳性率为29.25%。2013-2018年场阳性率分别为47.92%、57.04%、57.98%、64.84%、69.90%、65.84%，血清样品PRV野毒抗体阳性率分别为18.41%、25.38%、27.47%、31.49%、36.50%、30.13%。2013-2017年PRV野毒感染的猪场阳性率和血清样品PRV野毒抗体阳性率呈逐渐上升趋势，2018年两项阳性率略低于2017年。

表3 不同年份猪血清样品PRV野毒感染抗体检测结果Table 3 The detection results of PRV gE antibody in different years

2.2.2 不同年龄段猪血清样品PRV野毒感染的血清学检测结果 不同年龄段猪血清样品PRV野毒感染抗体检测结果见表4。结果显示，不同年龄段的猪存在一定比例的PRV野毒抗体阳性猪。2013年育肥猪和后备猪血清样品阳性率较种猪、产房小猪、保育猪高；2014年和2017年种猪和后备猪阳性率高于其他猪群；2015年和2016年后备猪阳性率低于其他猪群，2015年和2018年产房仔猪阳性率高于其他猪群。2014年后不同年龄猪群的PR野毒抗体阳性情况没有明显规律性，可能与猪场自采样品有关。

3 讨论

自2012年以来，我国多个省份均发生猪伪狂犬病的流行，发病率和死亡率明显上升，且出现了新的发病特征，给我国养猪业造成了重大的经济损失[9-11]。已有研究表明，与以前的流行株相比，新流行PRV毒株的抗原性已发生变异，现有疫苗不能提供完全保护，同时在全国不同地区分离出了PRV变异毒株[10-13]。范克伟[14]对2013-2014年闽西地区15株PRV流行株的分子遗传变异特征分析，表明闽西地区PRV流行株与当时国内不同省份分离的PRV株处于一个相对独立的分支中，均为PRV变异株。因此，了解PRV变异株流行后福建省西南地区PRV野毒感染趋势，对下一步猪伪狂犬病的防控具有重要的临床指导意义。

本研究利用PCR方法，对2013-2018年福建西南地区787个规模化猪场的疑似PRV感染组织样品共1320份进行病原学检测。结果表明，组织样本总阳性率为50.83%，猪场总阳性率为52.60%，其中2014年猪场组织样品阳性率为82.56%，猪场阳性率为79.63%，均高于其他年份；2015年保持较高水平，分别为68.03%、76.97%；2016-2018年PRV野毒感染组织样品及猪场阳性率相较于2013-2015年有所下降。本次调查结果显示，福建西南地区2013年PRV野毒组织样品阳性水平均高于唐佩娟（2013年，天津）[15]报道的16.7%、齐向涛（2013年，新疆）[16]报道的40.2%。PRV总阳性率高于王慧[17]（2013-2017年，湖南）报道的32.8%，但流行趋势与王慧等[17]和董雅琴等[18]报道的一致，总体呈下降趋势。

通过对2013-2018年采集的67 660份猪血清样品进行PRV野毒感染gE抗体检测，结果显示，血清样本总阳性率为29.25%，猪场总阳性率为61.13%。2014-2018年血清阳性率（25.38%、27.47%、31.49%、36.50%、30.13%）和猪场阳性率（57.04%、57.98%、64.84%、69.90%、65.84%），与2013年的18.41%、47.92%及前期对福建省部分地区猪伪狂犬野毒感染的血清学调查结果更高[19]，特别是场阳性率在2016-2018年处于较高水平（60%～70%）。董雅琴等[18]对我国猪群疫病流行情况分析证实，自2013年起猪场血清阳性率显著上升，2017年全国PR血清阳性率达到36.65%；李海琴等[20]报道江西省部分地区2016-2017年PR血清阳性率37.4%和猪场阳性率65.6%，较江西2016年之前的高；解伟涛等[21]报道河南省部分地区2014-2016年PR血清阳性率46.2%和猪场阳性率90.0%，王昌建等[22]报道湖南省部分地区2013年PR血清阳性率45.5%和猪场阳性率66.4%。调查结果表明，自PRV变异毒株流行后，福建省乃至全国PRV野毒感染阳性猪场和血清样品野毒抗体阳性比例处于较高水平。

从不同年龄段的猪群（包括流产死胎、产房仔猪、保育猪和育肥猪）中分析PRV病原感染情况，不同年龄段的猪群存在一定程度的PRV野毒感染，2014-2015年每个阶段猪PRV野毒检出率均较高，2016-2018年检出率均略有下降。血清学调查结果反映，2013年育肥猪和后备猪血清阳性率较种猪、产房小猪、保育猪高；调查结果表明，2013年以后育肥阶段的猪群已经存在野毒感染，但未引起养殖户的足够重视，直至2014年和2015年福建西南地区大范围发生猪伪狂犬病的疫情，导致2016-2018年PRV野毒抗体阳性猪场的场阳性率在60%以上，不同年龄段的猪组织样品有18.84%～41.67%的PRV野毒核酸阳性检出率，血清样品野毒抗体阳性率维持在24.27%～42.83%，表明PR的防控形势日趋严峻。

本研究数据全部来自有免疫PRV-gE基因缺失弱毒疫苗的猪场，gE基因缺失疫苗持续应用于猪群的免疫，使得通过实验室检测在临床上区分疫苗免疫猪与野毒感染猪成为可能。但从本次调查结果及我国PR流行现状分析，我国存在较高比例的PR野毒感染阳性猪场。种猪和后备猪是生猪可持续生产的源头，较高比例带毒种猪和后备猪成为猪场病毒的存储器。即使通过实验室可以检测区分野毒感染猪，在目前生猪价格居高不下，生猪产能需要继续提升的情况下，不可能全部淘汰阳性猪，阳性猪场短时间内不可能变成阴性猪场，使得伪狂犬病净化非常艰巨。本次病原学检测表明，产房仔猪和保育猪仍然存在一定比例的PRV野毒感染现象，这两个阶段猪群发病与母猪带毒有一定关系，带毒母猪在应激或其他免疫抑制病影响情况下通过垂直传播感染仔猪。尽管不少猪场采取商品猪免疫1～2次的免疫程序，但育肥猪的病原学和血清学检测结果表明，许多猪场育肥猪PRV野毒感染呈活跃状态，表明疫苗免疫未有效阻止猪只感染。有研究证明，伪狂犬病病毒抗体在90～120日龄后逐渐消失[23]，免疫过早易出现母源抗体干扰，免疫过迟则出现抗体空白期，导致猪群有暴露感染的风险。此外，育肥舍猪群密度大，有些猪场缺乏全进全出的生产管理措施，作为免疫抑制病如猪繁殖与呼吸障碍综合征和猪圆环病毒病的易发阶段，育肥猪再次感染伪狂犬病病毒野毒的压力增大。因此，现阶段，除加强生物安全等饲养管理措施外，通过病原学、血清学定期监测掌握PRV野毒感染动态，实时制定合理的免疫程序至关重要。以避免由于受生产不稳定、应激因子等因素影响，出现伪狂犬病病毒恢复排毒及临床发病症状，甚至伴随出现其他疫病的混合感染使得猪场的疫病控制更加复杂化的现象。