CRISPR/Cas9介导的果糖低消耗酿酒酵母工程菌的构建

陈红，赵风光，李战胜，杨家明，韩双艳

（华南理工大学生物科学与工程学院，广东省发酵与酶工程重点实验室，广东广州 510006）

肥胖、糖尿病等代谢疾病已经成为全球性危机，热量高的蔗糖等甜味剂的过多摄入造成能量过剩是其中一个重要原因[1]。D-阿洛酮糖（D-psicose）是近年发现的一种具有特殊保健作用的功能性甜味剂，甜度相当于蔗糖的70%，热量只有蔗糖的0.3%[2,3]。有研究报道，D-阿洛酮糖可以通过抑制关于脂质合成的酶活性而减轻腹部肥胖（Abdominalobesity），因此D-阿洛酮糖可用作减肥食品（diet food）的有效成分[4]。

当前的研究报道，大多集中在大肠杆菌中表达酮糖3-差向异构酶，然后用重组酶催化果糖生产D-阿洛酮糖[5,6]。就食品安全性来说，重组大肠杆菌进行D-阿洛酮糖生产并不太适合D-阿洛酮糖主要用于食品添加的需求。酿酒酵母一直被美国FDA（Food and Drug Administration）认为是GRAS（Generally Recognized As Safe）生产菌株，具备安全无致病性、遗传背景清晰、培养简单和繁殖迅速等优势，是功能性甜味剂D-阿洛酮糖的理想生产菌株[2,7]。

在酿酒酵母体内，己糖激酶同工酶2HXK2（hexokinase isoenzyme 2，GenBank：CAA96973.1）可以将果糖磷酸化形成果糖-6-磷酸，从而进入糖酵解代谢[8]。因此，有必要将hxk2基因敲除或功能弱化，从而降低宿主酿酒酵母对果糖消耗且改善目的产物D-阿洛酮糖的生产。在酿酒酵母中，利用蔗糖为底物生产果糖和乙醇时，HXK2的缺陷可以抑制细胞对果糖的消耗[9]。另外，通过利用分泌菊粉酶的酿酒酵母将菊芋转化为果糖的生产中，HXK2的缺失在减少酵母对果糖利用中发挥重要作用[10]。

CRISPR/Cas9技术被誉为第三代基因组编辑技术，2013年首次应用在酿酒酵母中[11]，随后因其具有低成本、易操作、普适性和高效性等多种优点[12]，在酿酒酵母中迅速得到推广应用[13-15]。……