miR-27b靶向BNIP3对缺氧/复氧心肌细胞β-catenin通路的影响

张韩，刘枫，李彦明，姚新亮，鲁雪丽

(河南大学淮河医院 a.心血管内科;b.重症医学科，河南 开封 475000)

急性心肌梗死是心血管疾病中发作极为危急的类型，通常因冠状动脉急性阻塞导致心肌缺血缺氧而发生坏死。目前，临床上通常采用再灌注治疗急性心肌梗死，但易发生心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤，影响疾病临床治疗及预后[1-2]。β-catenin是经典的信号传导通路，参与细胞增殖、分化、凋亡等众多生命活动的调控[3]。微小RNA-27b(miR-27b)是miRNAs家族成员之一，与多种肿瘤、多种心脏疾病的发生发展密切相关[4-5]。Bcl-2/腺病毒E1B 19-kDa相互作用蛋白3(Bcl-2/adenovirus E1B 19-kDa-interacting protein 3，BNIP3)是Bcl-2家族成员，在缺血再灌注过程中通过介导线粒体自噬影响心肌细胞损伤[6]，但是如何通过细胞通路影响这一过程不是十分清楚。本研究利用缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)心肌细胞模型模拟体内心肌I/R损伤，探讨miR-27b靶向BNIP3对H/R心肌细胞β-catenin通路的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器大鼠H9c2心肌细胞(货号：YBCC337726)购自美国ScienCell；DMEM培养基(货号：KL-P0032)购自德国merck/sigma公司；Lipofectamine 2000转染试剂(货号：11668019)购自Invitrogen公司；CCK-8试剂、BNIP3抗体、轴抑制因子1(Axin1)抗体、β-连环蛋白(β-catenin)抗体、GAPDH抗体(货号：ab228554、ab219609、ab233652、ab32572、ab181602)购自美国abcam公司；荧光定量PCR试剂盒、无序siRNA、miR-27b siRNA均由生工生物工程有限公司合成。恒温培养箱(型号：MIR-162-PC/MIR-262-PC)购自日本松下公司；荧光定量PCR仪(型号：ABI 7500)购自美国Applied Biosystems公司；酶标仪(型号：MODEL550)购自美国Bio-Rad公司。

1.2 实验方法

1.2.1细胞培养 将H9c2细胞培养于含体积分数为10%胎牛血清、1%双抗的DMEM培养基，37 ℃、5% CO2培养箱中，2～3 d换液1次，待细胞密度达到80%左右时，用2.5 g·L-1胰蛋白酶消化、传代培养。

1.2.2H/R模型建立及分组 取对数生长期H9c2细胞以每瓶2×105个接种于培养瓶中，培养24 h，弃上清液，换DMEM无糖无血清培养基，置于抽气型厌氧罐(先将罐中空气抽净在注入体积分数为5% CO2、94% N2、1% O2混合气体)于37 ℃密闭培养箱中培养3 h，即缺氧处理。……