靶向卵巢癌叶酸受体α的CAR-NK-92细胞构建及功能鉴定

杨 宇，敖 翔，李伟强，郭 韡，谭 燕，敖罗权，何 敏，王证程，徐 祥，郭建新

0 引 言

卵巢癌是发病率和死亡率最高的妇科肿瘤之一，目前以手术为主、辅以铂类和紫杉醇联合化疗的标准治疗方案并不能明显改善患者预后，卵巢癌患者的5年生存率仍不足30%[1-3]。因此，急需寻找新的卵巢癌治疗策略。

嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)结构通常包含识别肿瘤相关抗原的单链抗体(single chain fragment variable,scFv)和共刺激分子(costimulatory molecule,CM),通常为CD28、CD134或CD137，以及细胞内信号域免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs,ITAM)，通常为CD3或FcRI[4]。基于这种特殊的结构，表达CAR的免疫效应细胞能不依赖于MHC限制性和抗原提呈而特异性识别并杀伤靶细胞[5-6]。目前已有多项临床试验证实，CAR修饰的免疫细胞对白血病、淋巴瘤等多种恶性肿瘤治疗有效[5,7-8]。CAR技术的关键在于寻找肿瘤特异性或相关性的抗原[9]。αFR是一种糖基磷脂酰肌醇耦联蛋白，在正常组织中不表达或限制性低表达，但在90%的上皮性卵巢癌中高表达，并且其表达水平不受化疗药物的影响，故被认为是靶向治疗卵巢癌的理想抗原[10]。近期的研究认为，自然杀伤细胞本身就具有直接识别杀伤肿瘤细胞等特性，或许是更好的CAR负载细胞[11]。但目前，靶向αFR的CAR修饰NK-92细胞报道较少。

综上所述，本研究利用抗αFR的人源化抗体C4设计了靶向αFR的CAR(abti-αFR chimeric antigen receptor,αFR-CAR)，将该αFR-CAR基因构建到pLenti-EF1α-MCS-T2A-Puro慢病毒表达载体上，包装慢病毒感染NK-92细胞，制备NK-92-αFR-CAR细胞，鉴定CAR分子在NK-92细胞上的表达，并在细胞水平上进行功能实验，为下一步进行NK-92-αFR-CAR细胞的临床前和临床研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 细胞株及主要试剂人自然杀伤细胞系NK-92由美国俄亥俄州立大学余建华教授赠予，用含12.5%胎牛血清、12.5%马血清的α-MEM培养基培养。……