深山含笑叶片气孔的空间分布特征研究

焦亚冰，王容，时培建*

（南京林业大学生物与环境学院，江苏 南京 210037）

化石证据表明，早在4 亿多年前孢子体和配子体中出现了气孔。相较于茎和其他植物器官而言，气孔在叶片上的分布最为密集。气孔是由一对保卫细胞及其围成的孔隙所构成的，绝大多数陆生植物（苔藓植物到被子植物）的孢子体组织中都有气孔。气孔是陆地植物水分蒸腾和光合CO交换的主要通道，控制着叶片内部和大气之间的气体交换。植物通过控制气孔密度和气孔孔径大小来调节气体交换，以响应不同外界环境的刺激。长期以来，人们一直认为层级的叶脉和不透水的角质层是影响植物在陆地成功定植的关键因素，而气孔则往往被认为是不重要的影响因素。近年来，越来越多的研究表明，气孔功能的进化是植物登陆、大型植物进化的关键性创新。可调节的气孔与内部水分运输系统的结合是植物进化的一个转折点，使维管植物能够顺利入侵大多数的陆地环境。由此可见，气孔在植物进化过程中扮演着重要的角色。

空间点格局表示在给定空间范围内非重叠的点或事件（在平面上可近似认为是点）的空间排布和空间关系。例如，森林中树木的位置，星空中星星的位置，地震震中和疾病病例的发生地点。在空间点格局的分布中，通常划分为3 种分布类型：随机分布、均匀分布和集群分布。目前，大多数空间点格局分析方法都集中在非重复点过程上，只有少数研究应用重复空间点格局分析方法。在宏观领域层面，由于研究尺度较大、空间异质性很大、调查或者取样成本也较高，鲜有多个同质性重复的点格局；而本文在微观领域层面上使用点格局分析法，因其研究尺度较小，空间异质性可以得到有效的回避，可以使分析结果具有更高的稳健性。

深山含笑（Michelia maudiae）为木兰科含笑属植物，常绿乔木，是中国特有物种。木兰科植物起源悠久，在中国境内分布广泛，是被子植物进化线上幸存的起点，至今仍保留着许多古老的特征。其中含笑属植物全世界约有50 余种，中国就有40 种。深山含笑生长快、适应性强；花开素白、清香淡雅，树形美观，具有极高的经济价值和园林观赏价值。深山含笑具有典型的分层网状叶脉模式，网状叶脉可能使得气孔分布更为均匀，但鲜有研究，因此选择深山含笑作为研究对象。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2020 年9 月4 日，在南京林业大学校园内（118°80′E，32°08′N）选取一株进入成熟期的深山含笑，沿着树冠中层外围东、南、西、北四个方向共采集60 片叶片，不区分新老叶。挑选植株上具有代表性的、新鲜完整的、健康无虫害的叶片装入自封袋带回实验室。

1.2 气孔切片取样与气孔中心坐标提取

首先，采用离析法对叶片进行处理，经过固定—解离—染色—制片—镜检—拍照的过程获取气孔空间分布图。气孔切片取样如图1 所示，避开主脉和二级脉。其次，使用PhotoshopCS6（Adobe 系统公司）将从生物显微镜（Leica DM2500，徕卡显微系统上海有限公司，中国上海）拍摄的图片进行灰度图转换保存为JPG 格式，再使用版本4.0.4 的R软件手工逐点确认每个气孔的中心位置，以获得气孔中心的平面坐标。叶片气孔切片位置的气孔中心坐标提取示意如图2 所示。

图1 深山含笑的3 个切片位置的示意

图2 3 个位置对应的气孔中心坐标提取的示意

1.3 数据分析

1.3.1 k 函数与重复性空间点格局分析方法

K 函数是稳定的各向同性点过程二阶属性的特征化表示，它在距离s 处的定义为：

λ·K（s）=E[N（s）]

其中，λ 是在完全空间随机化假设下的强度，实际上等于单位面积上点（称为事件）的平均数量；N（s）表示到研究区域内任意一点距离≤s 的点的数量；E（·）表示期望；s 表示距离。

对于完全空间随机化的点过程，K（s）=πs。理论上，当K（s）＞πs时，事件倾向于聚集分布，即在距离s 事件之间相互吸引；当K(s)＜πs时，事件倾向于均匀分布，即在距离s 事件之间相互排斥；当K（s）=πs时，事件倾向于随机分布，即在该尺度下，事件之间不存在空间相互作用。

假设这里有g 个处理组（叶片上不同位置的切片），使用i 表示第i 个组（i=1，2，3，…，g）。设想第i个组有r个重复（叶片的数量），使用j 表示第j个重复。n表示第i 组的第j 个重复对应的点的数量，则

第i 个组总的点数量为：

引入D 统计量来检验组间K 函数是否存在显著性差异：

（3）计算组内均值、组间均值和基于重排的残差K 函数的D 统计量，记为D。

（4）重复步骤（2）和步骤（3）m-1 次，得到m-1个Dk*（k =1，2，3，…，m-1）统计量。将上述模拟得到的m–1 个统计量按照从大到小的顺序排列得到统计量向量D*，p 值等于实际的D 值在D统计量向量在排列中的位置与m 的商。在本研究中，m 设为1 000。假设D 排在第q 位，则P=q/m。

为了稳定化方差，一般使用交互类型的L 函数代替K 函数，实际上我们在重复性空间点格局分析中使用了L(s)-s 函数：

1.3.2 气孔密度和平均最近邻距离

气孔密度是植物对环境适应的指标。气孔密度=气孔数量/研究区域面积，即单位面积上的气孔数量。

对于区域A 中的n 个事件，令y为从第i 个事件到区域A 中其最近事件的距离。y被称为最近邻距离。n 个最近邻距离包含对最近邻事件对之间的重复测量。换句话说，就是每个气孔中心到与其最近邻气孔的中心之间的距离，然后计算所有这些最近邻距离的平均值，即为平均最近邻距离。

1.4 数据处理

利用线性混合模型和Pearson 积矩相关系数进行分析与检验，再使用版本4.0.4 的R 软件对混合线性模型进行拟合。

2 结果与分析

2.1 深山含笑表皮气孔分布

图3 展示了深山含笑上下表皮的显微形态：上表皮无气孔分布，仅有下表皮有气孔分布。

图3 深山含笑上下表皮形态（左为上表皮，右为下表皮）

2.2 气孔空间分布特征

小尺度（＜75 μm）下，气孔之间存在空间排斥，呈现均匀分布；在大尺度（≥75 μm）下，气孔之间不存在空间相互作用，呈现随机分布。深山含笑叶片最宽处的3 个位置之间的K 函数存在显著差异（P =0.001），然而2 号位置和3 号位置之间的K 函数不存在显著差异（P=0.052）。从叶缘到中脉的3 个位置，区分气孔之间排斥关系和独立关系的临界值是不同的（图4）。

图4 3 个位置估计的组内平均L(s)-s 函数

2.3 气孔密度与平均最近邻距离

1 号位置（靠近叶缘）和3 号位置（靠近中脉）的气孔密度之间存在显著差异，且3 号位置气孔密度高于1 号位置，气孔密度从叶缘到中脉逐渐增大（图5A）。3 个位置的平均最近邻距离之间存不在显著差异（图5B）。气孔密度和平均最近邻距离之间在对数- 对数轴上具有显著的负相关关系（图5C）。

图5 A:气孔密度的箱线B:每个切片中气孔之间的平均最近邻距离C:气孔密度和平均最近邻距离在对数-对数轴上的线性拟合结果

3 结论与讨论

3.1 气孔下生的意义

植物气孔的分布模式有三类：气孔上生（仅上表皮分布）、气孔下生（仅下表皮分布）和气孔两生（上下表皮均有分布）。影响气孔分布的因素有很多，其中有代表性的影响因素有叶片厚度、光照、生境和叶片着生角度等。自然界中的大多数物种（尤其是木本植物）都多属于气孔下生。本文的研究对象深山含笑是气孔下生。

气孔两生的分布模式具有明显的气体交换优势，与气孔上生或下生的叶片相比较，气孔两生的生产力更高。虽然气孔两生的分布模式于植物而言是益处良多，但是往往只有少数物种可以利用叶片两侧进行气体交换，这也意味着气孔两生的分布模式可能需要付出一些代价。其中一个代价就是病原体更容易通过上表皮的气孔进入。气孔是叶片角质层中的自然开口，真菌、细菌或病毒可能会通过气孔进入叶片，不同物种对病原体的易感性可能会因气孔分布而有所差异。此外，也有研究表明，气孔两生的分布模式会降低植物的水分利用效率，并且对于光合速率低的物种可能无益。

Parkhurst和Jones的模型都预测，当边界层阻力较高时，气孔下生比气孔两生的分布模式更有利。自然界中的大多数植物都属于气孔下生，这种分布模式可能有助于防止叶片的水分散失。大多数草本植物属于气孔两生，但许多木本植物则是气孔下生。Peat 和Fitter的研究表明，木本植物气孔下生的分布模式是植物的一种适应性性状，可能是因为木本植物的树冠通常比草本植物的树冠更发达，植物树冠保护的叶片边界层可能比没有保护的树叶更大。在自然进化中植物叶片上的气孔选择下生，一种可能的原因是，叶片上表面的气孔似乎比下表皮的气孔更容易被灰尘、雨水等堵塞。例如木兰科植物北美木兰属荷花玉兰（Magnolia grandiflora）的叶片下表面密被绒毛，可以有效阻挡灰尘、病原菌进入气孔。另一种可能的原因是，阳光照射下的叶表面比面朝下的叶表面温度更高。Buckley 等人通过对叶片能量平衡（0.2～0.3 ℃）的详细建模，发现阳光照射（不透光）和阴面蒸发的叶片表面温度存在显著差异。气孔下生的叶形态使最具光合活性的组织（栅栏叶肉）与外部环境的蒸发需求的形成了相对的隔离。因此，气孔下生的分布模式适应于大多数植物的原因可能与其对自然环境适应和其功能的进化有很大关系。

3.2 靠近中脉的气孔密度和靠近叶缘的存在显著差异的原因

通过对深山含笑叶片最宽处的3 个位置（叶缘、叶中、中脉）取样，可以更好地了解生长在南京地区的深山含笑的气孔分布差异。这种取样策略使我们能够对整叶上层级网状脉模式下的气孔空间分布有一个整体上的认知，前人的研究中取样多是在叶中，忽略了中脉附近和叶缘的气孔分布。

深山含笑的气孔密度从叶缘到中脉是逐渐变大，由此可以猜测这与光照强度有关。1928 年Salisbury在探讨气孔密度的成因及其生态学意义曾提出，气孔数量随着植物的“暴露”程度而增加。Kelly 和Beerling的研究表明，边缘草本植物（光照多）通常比阴生草本植物（光照少）有更多的气孔，并认为生活型越高或暴露越多的植物就越容易受到干燥条件的影响，往往其气孔密度也就越高。Gay和Hurd研究测定了生长室内高光和低光条件下生长的番茄植株的气孔密度：在低光下，上表皮气孔数不到1 个/mm，而在高光下，气孔数为30 个/mm；在下表皮，低光下气孔数约为80 个/mm，高光下气孔数约为100 个/mm。结果表明光照强度与气孔密度呈正相关关系。杨传友等人对金帅苹果的叶片进行多位置取样，其中中脉附近的气孔密度显著大于叶缘附近的，这与本文结果是一致的。自然界中，多数植物为了防止中午过多的热负荷和蒸腾，往往会选择将叶片进行一定程度的卷曲或特殊的叶角（如桉树叶片垂直于地面）等方式，提高叶片的水分利用效率和增加碳收益。深山含笑的叶片在应对高温时，其叶片呈现出一定程度的内合（沿着中脉），而其中脉附近的叶片往往受到更多的强光照射。因此，深山含笑叶片靠近中脉的气孔密度会显著高于靠近叶缘的。

深山含笑的气孔下生和气孔密度的差异，反映了植物对自然环境变化的适应。气孔密度与叶脉密度之间呈显著正相关关系，两者协调发展共同应对自然环境的压力。叶脉主要分为主脉和次脉（侧脉、细脉以及游离端细脉）。次脉占叶片脉络总长度的80%以上，是叶片水力传导力和光合速率的关键决定因素。游离端细脉是次脉的重要组成部分，在叶片内部，游离端细脉的数量随着网眼大小的增加而增加，网眼轮廓长度和气孔数量具有显著的正相关关系。因此，细脉的分布对气孔的大小和密度起到一定的限制作用，从而使气孔在网眼内更加均匀分布来实现资源最优化。在日后进行气孔相关研究时，不可只取叶片中部的材料作为代表，应该多方位考虑取样（如靠近主脉和靠近叶缘的位置）。

3.3 结论

深山含笑气孔为下生型；气孔与气孔之间在75 μm 以下存在空间抑制，在75 μm 及以上则不存在空间相互作用；在叶片最宽处从叶缘到中脉气孔密度显著增加，而平均最近邻距离显著降低；基于重复性空间点格局分析，靠近中脉的和靠近叶缘的切片气孔空间分布特征显著不同于靠近中脉的切片气孔空间分布特征。