甲基苯丙胺依赖者强制隔离康复戒断期Th/Treg 细胞 表达水平变化分析及其意义＊

李刚荣，焦西强，陈平力，白明明，杨会涛，陶朝欣，杨立峰， 马宗良，张成，张永峰，王志勇，邢江涛

（1.河北省强制隔离戒毒所戒毒医疗中心，石家庄 050081； 2.河北医科大学附属平安医院检验科，石家庄 050021）

药物成瘾是一个非常严重的社会问题，它不仅危害人体身心健康，还引起机体免疫功能紊乱导致各种并发症。有研究表明药物成瘾可直接或间接导致非特异性免疫功能损伤（补体系统异常）、体液免疫功能损伤（免疫球蛋白异常）及细胞免疫功能损伤（T 细胞亚群异 常）[1]。甲基苯丙胺（methamphetamine，METH）作为新型毒品的代表被吸毒成瘾者所青睐，它是一种强效中枢神经兴奋剂，对神经系统和免疫系统的损害尤为严重，长期METH 依赖患者机体内存在免疫功能紊乱或严重损伤。CD4+T 细胞在介导细胞和体液免疫反应方面起着重要作用，在不同的细胞因子及环境作用下可分化为功能不同的辅助性T 细胞（T helper cell, Th）Th1、Th2、Th17 及 调 节T 细 胞（regulatory T cells, Treg）。Th1 与Th2 细胞处于相互抑制、相互转化的平衡状态，平衡状态的破坏会导致免疫系统紊乱。Th17 分泌较高水平细胞因子IL-17，具有强大的促炎效应[2]，Treg 细胞是一类主要起免疫抑制作用的CD4+T 细胞，当Treg 发生紊乱并过度发挥作用时，会干扰机体的免疫力[3]，Th17及Treg 之间的平衡状态在机体免疫防御和免疫稳定中发挥着重要作用。随着苯丙胺类新型毒品大量被滥用且有替代阿片类传统毒品的趋势，戒毒康复监管场所对METH 依赖患者在监测治疗和诊断评估方面有更高的需求。已有的研究结果主要集中于传统毒品如阿片类的非特异性免疫和体液免疫方面，了解Th 细胞的表达水平变化有助于分析MEHT 依赖患者的细胞免疫功能状况。本次研究应用流式细胞术的方法检测METH 依赖患者外周血中CD4+T 淋巴细胞亚群的表达情况，对比分析在不同康复戒断时期该类患者外周血Th 细胞的变化，以期为该类患者临床诊疗提供相关数据，为康复戒毒医疗中心提供新的诊断评估指标。

1 对象与方法

1.1 研究对象

本次研究获得河北省强制隔离戒毒所戒毒医疗中心医学伦理委员会讨论批准后开展，所有参与患者均签署了关于本次研究的知情同意书。METH 依赖患者分为4 组，分别为METH 依赖患者初治组（康复戒断期0 个月组）、METH 依赖强制隔离康复戒断期6 个月组、12 个月组及20 个月组患者。METH 依赖患者初治组为2018 年6月至2019 年12 月由公安部门及强制隔离戒毒所根据相关检测确定的患者，吸食METH 时间均为半年以上，且最近一次吸食在15天以内，其中男性27例，女性3 例，年龄18～46 岁，平均年龄（29.4±5.8）岁；康复戒断期6 个月组为河北省强制隔离戒毒所2019 年12 月前收治的符合相关标准且自最后一次吸食METH后隔离康复戒断时间为6 个月的35 例患者，均为男性，年龄20～48 岁，平均年龄（31.2±6.6）岁；康复戒断期12 个月组为该所2019 年12 月前收治的符合相关诊断标准且自最后一次吸食METH 后隔离康复戒断时间为12 个月的35 例患者，均为男性，年龄18～51 岁，平均年龄（30.5±7.3）岁。康复戒断期20 个月组为该所2019 年12 月前收治的符合相关诊断标准且自最后一次吸食METH 后隔离康复戒断时间为20 个月的35 例患者，均为男性，年龄20～47 岁，平均年龄（32.2±6.5）岁。4 组患者一般临床资料比较差异无统计学意义，所有METH 依赖患者均用相关的心理测试软件测试过心理压力变化，均提示无异常，吸毒方式均为口服、口吸或鼻吸。30 例对照组为河北医科大学附属平安医院体检中心常规体检人员，其中男性26 例，女性4 例，年龄22～42 岁，平均年龄（32.3±5.3）岁，从未接触过METH 及类似药物。所有组别患者及对照组的乙肝、丙肝、艾滋病、梅毒、性病及其他传染病相关抗体检测均阴性，排除了可能影响免疫功能的疾病如心血管系统、呼吸系统、消化系统疾病及免疫系统疾病等，无影响相关因子检测的用药史。

1.2 仪器和试剂

仪器为BD 公司的FACS Calibur 8 色流式细胞仪，主要试剂有：小鼠抗人CD4 单克隆抗体（mAb）抗体为PerCP-Cy5.5 荧光标记，IFN-γ 为FITC 荧光标记，IL-4 为PE 荧光标记，IL-17A 为BV510 荧光标记，小鼠抗人CD25mAb 为PE 荧光标记，小鼠抗人CD127 mAb 为Alexa Fluor 647 标记，小鼠抗人IgG 作为同型对照，leuko Act Cktl With GolgiPlug 刺激剂，红细胞裂解液，流式分析用溶血素，以上产品均购自BD 公司。

1.3 标本采集与处理

患者及体检者清晨空腹抽取EDTA 抗凝的静脉血 5 ml，标本无溶血、凝血及乳糜血现象。

Treg 细胞检测标本在采集之后2 小时内完成，操作步骤为吸取无异常的抗凝全血50 μl 加于专用流式上机管中，加入CD4- PerCP-Cy5.5、CD25-PE、CD127-Alexa Fluor 647 抗体各20 μl，同型对照管加入同型抗体 20 μl，充分混匀后室温避光放置30 分钟，再加入 2 ml 红细胞裂解液室温放置15 分钟后离心弃上清，加入2 ml PBS 洗涤沉淀后再次离心弃上清，最后加入0.5 ml PBS 重悬，使用流式细胞仪BD FACS CantoII 检测，数据分析采用FACSDiva 软件，记录阳性细胞百分率。以前向散射光和侧向散射光圈定淋巴细胞，再以CD4+和侧向散射光圈定CD4+T 淋巴细胞，Treg 细胞的比例以CD25+CD127-占CD4+T 淋巴细胞的百分比表示[4-5]，见图1—图2。

Th1/Th2/Th17 细胞检测标本在采集之后2 小时内完成，操作步骤为取抗凝全血100 μl 加入试管同时加入leuko Act Cktl With GolgiPlug 刺激剂2 μl，充分混匀，37 ℃ CO2培养箱孵育6 小时，PBS 洗2 遍，分别加 入CD45-APC 5 μl、CD4-PE-Cy 20 μl、CD8-Percp 20 μl，室温避光15 分钟，PBS 洗2 遍，加流式分析用溶血素1 液100 μl 固定15 分钟，待完全溶血后离心弃上清，加入流式分析用溶血素2 液100 μl 透膜5 分钟，加入IFN-γ-FITC/IL-4-PE 20 μl，IL-17ABV510 5 μl 室温避光孵育15 分钟，加入2 ml PBS 洗涤沉淀后再次离心弃上清，最后加入0.5 ml PBS 重悬，使用流式细胞仪BD FACS CantoII 检测，数据分析采用FACSDiva 软件，记录阳性细胞百分率。以 CD4+IFN-γ+细胞占CD4+T 细胞的百分比表示Th1 细胞水平，以CD4+IL-4+细胞占CD4+T 细胞的百分比表示Th2 细胞水平，以CD4+IL-17A+细胞占CD4+T 细胞的百分比表示Th17 细胞水平。

图1 正常对照组外周血Treg 细胞表达情况

图2 康复戒断期6 个月组外周血Treg 细胞表达情况

1.4 统计学分析

应用SPSS 25.0 对本研究数据进行分析处理，计量资料以（±s）表示，数据符合正态分布，组间比较采用t 检验，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），检验效能α=0.05，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 METH 依赖患者初治组与正常对照组外周血各类淋巴细胞亚群比较

METH 依赖患者初治组外周血中CD4+T 细胞、Th1、Th17 细胞比例、Th1/Th2 及Th17/Treg 比值均低于正常对照组，Th2 及Treg 细胞比例明显高于正常对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 METH 依赖患者不同戒断时期各类淋巴细胞亚群变化特点

METH 依赖患者在强制隔离康复戒断0 个月至第20 个月期间，其外周血CD4+T 细胞与Th1 细胞呈不断上升趋势，Th2 与Treg 细胞呈不断下降趋势，而Th17始终处于较低水平（表1）。Th17 细胞在METH 依赖患者中表达明显降低，至康复戒断期20 个月时仍低下，与正常对照组比较差异有统计学意义（P=0.037），Th17/Treg 比值在康复戒断期20 个月时与正常对照组比较，差异无统计学意义（P=0.080）。

3 讨论

近年来针对METH 影响免疫功能的研究有限，但其影响机体先天和后天免疫已得到证实。Th 细胞分泌不同的细胞因子且发挥不同的免疫作用，Th1 细胞主要介导细胞免疫，Th2 细胞主要介导体液免疫，Th1/Th2 的动态平衡状态一旦偏离，机体就会趋向疾病状态。有学者研究发现传统阿片类物质依赖可引起Th1细胞功能低下，Th2 细胞功能亢进，Th1/Th2 比例失衡[6]。本次研究结果与传统阿片类物质依赖基本一致，显示METH 依赖患者Th1 细胞受抑制，Th2 细胞优势表达，外周血CD4+T 淋巴细胞减少和Th1/Th2 平衡状态的破坏，导致机体免疫系统产生不利的免疫激活，可能与该类患者感染性疾病的发生密切相关。至康复戒断期12 个月时，Th1 与Th2 仍不能恢复正常平衡状态，也提示METH 对机体免疫功能损伤的长 期性。

表1 不同戒断期METH 依赖患者淋巴细胞亚群表达情况（±s）

表1 不同戒断期METH 依赖患者淋巴细胞亚群表达情况（±s）

注：▲METH 依赖患者初治组与正常对照组比较P＜0.05；*Th17 细胞与正常对照组比较P=0.037；★Th1/Th2 与正常对照组比较P＜0.05；△Th17/Treg 与正常对照组比较P=0.080；■Treg 细胞与正常对照组比较P=0.137；□Treg 细胞与正常对照组比较P=0.771。

组别 CD4+/% Th1/% Th2/% Th17/% Treg/% Th1/Th2 Th17/Treg METH 依赖患者初治组（n=35） 41.47±4.60▲ 9.16±3.90▲ 3.08±1.68▲ 0.66±0.38▲ 3.83±0.77▲ 4.40±4.15▲ 0.18±0.12▲康复戒断期6 个月组（n=35） 41.97±5.20 11.88±4.05 2.43±1.14 0.46±0.41 4.01±1.52 6.44±4.45 0.13±0.12康复戒断期12 个月组（n=35） 44.87±8.54 15.27±5.11 2.41±1.31 0.65±0.38 3.50±1.34■ 9.71±10.59★ 0.22±0.16康复戒断期20 个月组（n=35） 46.71±7.30 13.45±6.69 1.11±0.81 0.83±0.39* 3.17±0.99□ 16.85±9.68 0.29±0.17△对照组（n=30） 46.46±6.11 14.81±5.35 1.27±0.55 1.13±0.62 2.92±0.92 14.39±10.17 0.42±0.31

Treg 细胞是CD4+T 细胞的新亚群，在维持机体免疫自稳、调控免疫应答方面起着重要作用，可抑制炎症的发展，Th17 细胞在维持上皮组织的完整和抵御外来病原感染中发挥着重要作用，是诱导炎症反应的关键效应T 细胞，Treg 细胞与Th17 细胞在功能上互相拮抗，生理状态下处于动态平衡，维持机体免疫功能的平衡与稳定。本次研究结果显示METH 依赖初治组患者外周血Treg 细胞水平较正常对照组明显升高，而Th17 细胞表达则显著降低。Treg 细胞比例升高可导致机体免疫抑制，Th17 细胞降低会抑制炎性反应，两者动态平衡的破坏可能是引起该类人群免疫力低下易患感染性疾病的原因之一。有研究显示成瘾药物依赖患者体内免疫功能紊乱且持续时间较长，发现戒断期18 个月时其外周血Treg 细胞比例高于正常对照组，表明成瘾药物依赖患者体内Treg 长期存在过度表达[7]。本次研究结果显示METH 依赖患者外周血Treg 细胞在康复戒断期12 个月组及20 个月组时与正常对照组比较，差异无统计学意义（P=0.137，P=0.771）。单纯METH 依赖与传统阿片类毒品相比对中枢神经毒性的影响更大，新型毒品苯丙胺类物质会对患者脑组织中多巴胺的摄取、储存以及释放造成影响，可增加IL-6、IL-1β、TNF-α 和IL-8 的分泌[8]，此类细胞因子的存在会影响到Treg 和Th17 细胞在一定条件下的表型转化，这是否是导致结果存在差异的原因有待进一步的探讨。本次研究未对符合条件的患者从康复戒断期开始到结束时各淋巴细胞亚群水平进行全程跟踪监测，同一患者在不同戒断期间的Treg 细胞水平变化数据也会为差异的原因提供更有力的证据。

综上所述，甲基苯丙胺依赖患者随着康复戒断期限的延长，其外周血Th 细胞各项指标逐步恢复，在康复戒断期间监测其CD4+T 细胞、Th1、Th2、Th17 及Treg细胞表达水平的变化，有助于了解该类患者机体的免疫功能状况，为强制隔离戒毒康复医务工作者提供新的诊断评估指标。《中华人民共和国禁毒法》第四十七条规定强制隔离戒毒的期限为两年，本次研究提示METH依赖患者在康复戒断期第20 个月时其机体内除Th17细胞外，其余Th 细胞的表达水平与正常对照组比较差异无统计学意义，间接为METH 依赖患者强制隔离康复戒断期限提供理论依据。

鸣谢：本次研究得到河北省女子强制隔离戒毒所戒毒医疗中心、石家庄市第一强制隔离戒毒所戒毒医疗中心及相关部门的大力支持，特此感谢。