TLN-58和hLYZ基因融合表达载体的构建及其细胞毒性研究

王小月，李丹，蓝肇煜，武静桥，范真玮，姚景丽，何敬文，赵微，陈婷，金天明

(天津农学院动物科学与动物医学学院，天津 300384)

抗菌肽(antimicrobial peptides)是一类具有免疫功能的小分子多肽，由10～60个氨基酸残基构成，广泛存在于各种生物体内[1]。由于抗菌肽易被蛋白酶分解，在生物体内不易形成残留，因此，不易形成耐药性，现已成为抗生素替代领域的研究大热点。TLN-58是2016年被发现于人掌跖脓疱病中的一种抗菌肽[2]，含有58个氨基酸，带有7个静正电荷，疏水性为34%，对人红细胞无溶血活性，对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和链球菌均具有抑菌活性[3]。人溶菌酶(human lysozyme，hLYZ)又名N-乙酰基胞壁酸水解酶，是人体免疫防御的组成部分，其通过水解细菌细胞壁中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺之间的β-1，4糖苷键而起到裂解细菌的作用[4]。hLYZ抗菌作用广，因独特的作用机理使得其不会产生抗药性、耐药性、药物蓄积、药物残留及其他副作用。hLYZ对致病菌(包括革兰阳性和阴性菌)都具有明显的抑菌作用，还可增强机体的免疫力[5]。鉴于上述特性，本试验对TLN-58和hLYZ融合基因的细胞毒性进行检测，为后续利用hLYZ和TLN-58融合基因替代常规抗生素时的安全性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试验材料

pMD-TLN-58(KanR)、pMD-hLYZ(KanR)、pEGFP-N1 Vector(KanR)、大肠杆菌XL-10Gold感受态细胞购自上海捷瑞生物工程有限公司；HEK293细胞由天津农学院预防兽医学实验室保存。

1.2 重组真核质粒的构建

根据The Antimicrobial Peptide Database中的TLN-58基因序列(APD ID：AP02750)和GeneBank中hLYZ基因标准序列(NC_000012.10)结合真核表达载体pEGFP-N1分别设计特异性引物(见表1)，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。……