大肠杆菌CRISPR/Cas9基因编辑系统的建立及验证

卞晓萍，刘 青，孔庆科，罗洪艳，李 沛

(西南大学 动物科技学院，重庆 北碚 400700)

目前广泛应用于大肠杆菌基因敲除的方法有噬菌体重组酶介导的λ-Red重组系统，该技术的原理是将一段携带有靶基因两侧各40～60 bp 同源序列的 PCR 产物或合成的寡核苷酸片段，通过电转化法导入宿主菌内，然后在Red重组酶的作用下，使导入宿主菌内的线性 DNA 片段与基因组上的特定靶序列进行高效的同源重组，从而将靶基因置换下来[1-2]。虽然λ-Red同源重组系统是细菌基因敲除的有力技术，但是通过FLP重组酶去除抗生素标记会在细菌的基因组上留下FRT疤痕[3]。在标准λ-Red同源重组系统中，每个转入的线性 DNA 片段均编码一个选择性的抗生素抗性标记，其两侧的FLP位点是 FRT疤痕的来源。如果使用该方法在同一个细菌中引入多个突变，则每次突变成功后遗留下的FRT疤痕都会影响下一个突变的成功率，比如：FLP重组酶可能会消除基因组上任意两个相邻的FRT位点，得到并非我们想要的突变；同时，过多的疤痕会使宿主菌的基因组变得不稳定，有可能发生基因组的重排[4]。本研究应用的无痕缺失方法与此相反，不会留下任何疤痕。除了λ-Red重组系统，自杀质粒介导的同源重组基因敲除方法也应用较为广泛，但该方法对某些保守且敲除困难的基因筛选效率极低，这也限制了该技术的应用。

在细菌和古细菌中发现的CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)与Cas蛋白共同作用可协助细菌抵御外源质粒、噬菌体等的侵害。其中，在嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)中发现的Ⅱ型 CRISPR/Cas9系统组分较为简单，操作较容易，是目前研究的热门工具，也是本研究所应用的CRISPR/Cas系统。……