Cocktail探针法评价牛樟芝醇提物对人CYP450酶活性的影响

魏文增 赵宁宁 林颖烽 王瑾 王宫

摘 要：目的：研究牛樟芝醇提物对人肝CYP450酶的影响。方法：建立HPLC方法，通过Cocktail探针检测樟芝醇提物对人CYP450酶的影响。结果：牛樟芝各剂量组对CYP3A4/5有抑制作用;低剂量组对CYP2E1有促进作用，中、高剂量对CYP2D6、1A2、2E1、2C9亚型作用具有促进作用。结论：牛樟芝醇提物能促进人CYP1A2、2C9、2D6、2E1的活性;可以抑制CYP3A4/5代谢。

关键词：Cocktail;探针底物;HPLC;牛樟芝;人肝微粒体

牛樟芝（Antrodia camphorata）又称樟菇、红樟等，原产于台湾的一种珍稀药用真菌，被称为“森林红宝石”，近年来，研究表明其具有解毒保肝、补肾强心、抗癌等[1]神奇功效。

目前，中药与西药治疗各有其优缺点，而在临床治疗中，为了标本兼治，提高疗效，中西药合用越趋频繁，但也有许多文献报道中药与西药合用后产生严重的不良反应。基于牛樟芝的功效，其在疾病预防与保健方面也受到关注;而牛樟芝与其他药物合用是否会产生相互作用，导致药效降低或增强以及毒性反应，还尚未有文献报道。因此有必要对牛樟芝的代谢进行深入的研究。

1 仪器与试药

1.1 仪器

U3000型高效液相色谱仪，戴安公司;MQD-S3恒温振荡箱，上海旻泉公司。

1.2 試药

非那西汀，美托洛尔，奥美拉唑，氯唑沙宗，甲苯磺丁脲，硝苯吡啶，甲硝唑（批号：62-44-2，56392-17-7，73590-58-6，95-25-0，64-77-7，21829-25-4，443-48-1）源叶生物;NADPH（2646-71-1）TCI公司。

1.3 人肝微粒体

人肝微粒体（3MSMC004）武汉普莱特生物有限公司。

2 方法与结果

2.1 终止液配制

取适量的甲硝唑，加乙腈溶解，配成13mg·mL-1备用。

2.2 探针溶液配制

美托洛尔108.12μmol·mL-1、奥美拉唑95.99μmol·mL-1、非那西汀215.96μmol·mL-1、氯唑沙宗216.49μmol·mL-1、甲苯磺丁脲144.19μmol·mL-1、硝苯吡啶93.94μmol·mL-1储备液，以甲醇为溶剂，按比例配制成Cocktail混合探针。

2.3 孵育体系

肝微粒体10μL、探针2.5μL：美托洛尔/奥美拉唑/非那西汀/氯唑沙宗/甲苯磺丁脲/硝苯吡啶，终浓度为30/26.7/60/60/40/26（μmol·L-1）、PBS补至500μL，置37℃孵育5min后，加NADPH 20μL孵育30min。

2.4 样品处理

向体系加500μL含0.76μmol·mL-1内标（甲硝唑）的乙腈溶液终止反应，涡旋3min后离心（15000r·min-1）15min，取上清，挥干，复溶，过滤，进样。

2.5 色谱条件

C18柱，流动相为乙腈-磷酸氢二铵缓冲液，梯度洗脱，柱温35℃，波长230nm，进样量20μl。色谱图见下图，可见探针间分离良好，且未见干扰。

2.6 标准曲线制备

在灭活体系（肝微粒体100℃加热10min）中加入探针如下：美托洛尔/奥美拉唑/非那西汀/氯唑沙宗/甲苯磺丁脲/硝苯吡啶，90/80/180/180/120/78μmol·L-1;60/53.3/120/120/80/52;30/26.7/60/60/40/26;15/13.3/30/30/20/13;75/667/15/15/10/6.5;3.75/3.33/7.5/7.5/5/3.25;1875/1665/375/3.75/2.5/1.625。以样品与内标峰面积比值为纵坐标，浓度为横坐标，则方程：美托洛尔Y=0.004X+0.007（R2=09990）、奥美拉唑Y=0.001X+0.004（R2=09985）、非那西汀Y=0.003X+0.002（R2=0.9990）、氯唑沙宗Y=0.002X+0.011（R2=0.9985）、甲苯磺丁脲Y=0.005X+0.005（R2=09995）和硝苯吡啶Y=0.004X-0.006（R2=09990），显示线性良好。

2.7 精密度试验

加低、中、高浓度探针：美托洛尔/奥美拉唑/非那西汀/氯唑沙宗/甲苯磺丁脲/硝苯吡啶7.5/6.67/15/15/10/65μmol·L-1;30/26.7/60/60/40/26;90/80/180/180/120/78。同2.3—2.5项操作。结果：美托洛尔0.65%—3.61%，奥美拉唑0.38%—8.82%，非那西汀0.27%—3.97%，氯唑沙宗0.26%—3.99%，甲苯磺丁脲0.12%—3.63%，硝苯吡啶0.92%—8.95%。

2.8 回收率试验

同2.7项操作。结果：美托洛尔103.57%—106.68%，奥美拉唑72.83%—80.46%，非那西汀97.25%—100.43%，氯唑沙宗96.41%—105.23%，甲苯磺丁脲97.26%—104.74%，硝苯吡啶77.15%—89.89%。

2.9 对人CYP450酶亚型影响试验

分无活性组，无樟芝组，樟芝组。结果显示，樟芝低剂量组仅对CYP2E1和3A4/5亚型代谢具有显著作用（P<0.01）;中、高剂量组对CYP2D6、1A2、2E1、2C9、3A4/5亚型的作用具有显著性差异（P<0.05或P<0.01）如下表。

2.10 统计学处理

实验数据处理采用GraphPad Prism5.0统计软件，数据资料采用x-±s表示，组间比较用t检验。

3 讨论

“Cocktail”探针法[2]，即对单一的受试体，混合多种探针底物同时给药进而评价CYP酶的活性能更全面反映药物代谢过程。对CYP酶的测定是进行新药筛选必须进行的一項临床前试验[3]。本实验中CYP亚型探针底物的选择依据美国FDA发布的药物相互作用研究指导原则，经实验表明该混合底物经代谢后检测无相互影响。

牛樟芝含有许多复杂生理活性物质成分，其中三萜类是主要活性成分之一[4]，被当成中毒，腹泻，腹痛等解毒剂[5-7]。但目前还未对其解毒作用的成分和机制进行深入的研究[5]。本实验通过牛樟芝醇提物对人CYP酶亚型作用，研究结果显示低剂量组对CYP2E1和3A4/5亚型代谢分别具有显著的促进和抑制作用，而对其他亚型代谢则无显著性;此外，牛樟芝醇提物中、高剂量能促进CYP1A2、2C9、2D6、2E1的代谢活性，这可能是其解毒保肝的作用机制之一。本实验研究结果提示牛樟芝醇提物对人肝微粒体CYP1A2、2C9、2D6、2E1亚型具有诱导作用，对CYP3A4/5亚型显示一定的抑制作用。

参考文献：

[1]陈菲，刘训红，杨念云，等.樟芝的研究概述[J].中药材，2011，（11）：1804-1808.

[2]Tanaka E，Kurata N，Yasuhara H.How useful is the "cocktail approach" for evaluating human hepatic drug metabolizing capacity using cytochrome P450 phenotyping probes in vivo[J].J Clin Pharm Ther，2003，28（3）：157-165.

[3]魏文增，黄慧玲，叶丽香，等.钩吻素子在人和猪、大鼠、猴、犬肝微粒体的酶促动力学及CYP450酶亚型分析[J].福建医科大学学报，2017，51（2）：82-87.

[4]杨璐，黄正明.牛樟芝研究进展[C].中国医药教育协会第三届三次理事大会暨学术年会论文专辑，2013，228-232.

[5]蔡为明，金群力，蔡青松，等.牛樟芝人工培养及活性成分与药理作用的研究进展[J].食药用菌，2015，23（1）：17-23.

[6]李俊鹏，金毅，王平，等.牛樟芝胶囊对大鼠四氯化碳肝损伤的保护作用研究[J].中国药师，2013，16（7）：964-966.

[7]张薄博，夏永军，许赣荣.樟芝发酵产品的研究进展[J].食品开发，2012，37（10）：89-91.

基金项目：福建省公益类科研院所专项（2018R1035-9）

作者简介：魏文增（1988— ），男，汉族，福建福州人，硕士，研究实习员，研究方向：药物代谢和毒理学研究。