miR-34b-5p上调抑制弥漫大B细胞淋巴瘤的侵袭及RhoA／ROCK信号通路

李敬东，韩效林，杨 翠，高攀科，陈小双，梁勇会

弥漫性大B细胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）是一种高度异质性的恶性淋巴瘤。治疗DLBCL的标准方案是每21天进行1次利妥昔单抗、泼尼松、阿霉素、长春新碱和环磷酰胺的化学免疫疗法（rituximab，prednisone，doxorubicin，vincristine and cyclophosphamide，R-CHOP）。根据国际预后指数（international prognostic index，IPI）判断预后，对于IPI风险评分低级的患者，R-CHOP的治愈率超过80%，但在IPI风险评分高和中级的患者中，预后仍不理想。同时由于耐药性的快速出现，导致有30% ～40%的患者复发。先前研究表明，微小核糖核酸（microRNA，miRNA）能够参与调节癌细胞的恶性生物学行为。已经确定miR-34是关键的抑癌基因，其靶基因参与了耐药机制的形成，同时耐药癌细胞中低水平的miR-34被升高，化疗药物的敏感性被恢复。并且研究表明在甲状腺癌、乳腺癌和炎症相关肠癌中 miR-34b-5p表达量均下降。该研究主要检测miR-34b-5p过表达是否对SU-DHL-4细胞增殖、侵袭、凋亡及RhoA／ROCK信号通路有影响。

1 材料与方法

1.1 细胞培养与处理 DLBCL SU-DHL-4细胞购自中国科学院的细胞库，并用含10%胎牛血清的Dulbecco改良的 Eagle培养基（Dulbecco′s modified eagle medium，DMEM）进行培养于37℃生长。miR-34b-5p mimic和mimic-NC根据制造商的说明，使用Lipofectamine 2000试剂（美国Invitrogen公司）转染到SU-DHL-4细胞。

1.2 总RNA提取、反转录和荧光定量 使用TRIzol从SU-DHL-4细胞提取总RNA，提取的总RNA首先去除基因组中的DNA，然后进行反转录，以上步骤按照产品说明书进行操作。荧光定量检测反应体系：5μl的SYBR Premix，各0.5μl的上游引物和下游引物，3μl的 RNase Free dHO，1μl的 cDNA。程序：95℃预变性2 min，95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40个循环。扩增完成后进行溶解曲线分析：95℃维持10 s，65℃处理1 s，此后从65℃开始，每1个循环温度增加0.5℃，时间为1 s。

1.3 菌落形成实验 将SU-DHL-4细胞转染miR-34b-5pmimic和miR-NC进行处理，在无毒培养基中培养大约14 d。……