干扰长链非编码RNA CCAT2对膀胱癌细胞J82线粒体功能和肿瘤干细胞样特性的影响

白晓静，蒋玉梅，张 静，范晋海

膀胱癌属于泌尿系统疾病，其发病率占恶性肿瘤第11位，是中国泌尿系统发病率、死亡率最高的疾病之一，其中男性发病率稍高于女性。近年来，膀胱癌发病率呈现出增长的趋势，严重影响人们的生命健康安全。目前诊断膀胱癌主要为膀胱镜检与尿细胞学联合检查，但膀胱镜检过程易出现出血、感染风险，尿细胞学检查准确性易受机体炎症反应的影响。因此，膀胱癌早期诊断研究逐渐转向基因相关肿瘤标志物等方面发展。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是长度 ＞200 bp、无开放阅读框、异质性强的RNA群体，参与细胞增殖、分化、凋亡等过程。lncRNA UCA1在膀胱癌特异性表达，具有较高的诊断价值，异常表达可以促进膀胱癌细胞侵袭、转移，可以作为分子标志物。lncRNA CCAT2可以通过调控miR-200b／VEGF在骨肉瘤中充当癌基因，还可以促进EZH2表达促进肝细胞癌HCC细胞增殖、侵袭、转移，从而促进肝细胞癌进展，但有关lncRNA CCAT2在膀胱癌中的作用研究报道较少。因此，该研究通过干扰膀胱癌细胞J82 lncRNA CCAT2，探索其对J82细胞的影响及可能存在的作用机制，为分子靶向治疗提供试验参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料与主要仪器 膀胱癌细胞J82（美国ATCC），CCAT2-shRNA（前引物 5′-UUA ACC UCU UCC UAUCU-3′，后引物 5′-UGA GAU AGG AAG AGG UUAA-3′）及 shRNA-NC（前引物 5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3′，后引物 5′-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3′）载体由上海吉玛制药技术有限公司提供，线粒体膜电位检测试剂盒（Solarbio），Lipofectamine2000（Thermo Fisher Scientific），Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9、c-Myc、TCF4、OCT4、SOX2、CD44／Actin抗体（Cell Signaling Technology），ECL Kit（Thermo Fisher），青霉素（Merck-KGaA），链霉素（Darmstadt），DNR BioImaging System（DNR，Israel），10%胎牛血清（Sigma-Aldrich），TRIzol Kit（Thermo Fisher Scientific），SYBR-Green PCR（TAKARA），Revertaid First Strand cDNA Kit（Thermo Fisher）。高速冷冻离心机（Beckman Coulter），实时荧光定量PCR仪（罗氏），流式细胞分析仪（贝克曼库尔特）。

1.2 细胞培养与转染试验 膀胱癌细胞J82培养于含10%胎牛血清、100 U／ml青霉素或链霉素的完全PRMI1640培养液培养，并在37℃的5% CO的加湿培养箱中培养至对数期，0.25%胰蛋白酶消化液处理制成细胞悬液，采用第3代细胞用于后续实验。……