CCL23及其受体CCR1与人上皮性卵巢癌细胞顺铂耐药的研究

孙 磊，张 英，朱 颍，李泽莲，颜士杰，肖 兰

上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer，EOC）是卵巢癌中最为常见的类型之一，因其发病隐匿，多数患者就诊时常为晚期，且规范治疗后易发生铂类耐药导致患者预后较差。该课题组前期研究发现，EOC组织趋化因子配体 23（C-C chemokine ligand 23，CCL23）及趋化因子受体1（C-C chemokine receptor 1，CCR1）表达水平明显高于正常卵巢上皮组织，提示CCL23及其受体CCR1可能参与EOC发生发展过程。为了进一步了解 CCL23及其受体CCR1与EOC顺铂耐药之间关系，该研究采用慢病毒转染将CCL23导入CCL23表达较低的OV2008细胞，再联合 CCR1抑制剂 BX471，旨在探讨CCL23／CCR1趋化因子受体轴在EOC顺铂耐药中的作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料与主要试剂 细胞株：人EOC耐药细胞C13K及人EOC敏感细胞OV2008均为安徽医科大学免疫实验室保存；1640培养基、PBS购自美国Hyclone公司；胎牛血清购自德国GIBGO公司；RIPA裂解液、BCA法蛋白浓度定量试剂盒、CCK-8检测试剂盒、ECL显色试剂盒购自上海碧云天公司；BX471试剂购自上海碧云天公司；TRIzol试剂购自美国InvitroGen公司；逆转录试剂盒、RT-PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司；CCL23抗体及CCR1抗体购自美国Abcam公司；YAP抗体购自美国 CST公司；LV5-CCL23过表达慢病毒购自上海吉玛公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 C13K细胞和OV2008细胞用含15%胎牛血清的1640培养液，在5% CO、37℃条件下，饱和湿度培养箱中培养。

1.2.2 细胞转染 ① 转染前1 d在6孔板中以（1～1.5）×10个／孔接种相应浓度处于对数期OV2008细胞；②转染分组：CCL23过表达组及空载体组；③按照MOI值为75行慢病毒转染，37℃孵育箱中孵育，48～72 h后在荧光显微镜下观察转染效率；④ 待细胞长至70% ～80%时，5μg／ml嘌呤霉素筛选 14 d，得到 CCL23过表达及空载体OV2008阳性克隆株。

1.2.3 倒置荧光显微镜观察细胞荧光表达 倒置荧光显微镜下观察处于对数生长期CCL23过表达及空载体OV2008阳性克隆内绿色荧光表达，图片经图像处理软件Image J统一进行处理以获得更好的显示结果。……