基于质谱测定小分子与Aβ亲和力的受体结合分析方法的建立和验证

彭丽朵，代雅倩，徐元宏，吴丹丹，江桃山，乔金平

阿尔茨海默病（alzheimer′s disease，AD）是一种神经退行性疾病，淀粉样蛋白-β（Aβ）斑块是AD病理学特征之一，主要有Aβ1-40和 Aβ1-42两种形式，通过PET等检测Aβ斑块可用于AD的早期诊断。硫黄素 T（Thioflavin T，ThT）的类似物，包括11C-PIB、IMPY是常见的分子探针，其中IMPY与Aβ的亲和力强、特异性好，所以常被用作放射性受体结合分析中的阳性参比配体。Aβ分子探针开发早期，常使用放射性受体结合实验检测其与Aβ的亲和力。尽管该方法灵敏度高、重复性好，但放射性同位素（H、I）标记带来了一系列成本及安全问题。随着质谱技术的发展，结合液相色谱 -质谱（liquid chromatography-massspectrometry，LC-MS）的高灵敏度，有研究小组开发出基于质谱的受体结合分析方法（MS binding assays，MSBA），使用非放射性配体并经质谱进行定量检测。该研究旨在建立基于LC-MS的受体结合分析方法，测定IMPY的亲和力，并与文献中放射性受体结合实验数据相比较，验证MSBA的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 IMPY（CHIN，363.20 g／mol）、IMPY-D（CHDIN，369.23 g／mol）由安徽农业大学生命科学学院合成，人Aβ1-40及Aβ1-42购自广州市锐博生物科技有限公司，乙腈购自美国TEDIA公司，牛血清白蛋白（BSA）购自上海生工生物工程有限公司。

1.1.2 主要仪器 API 3200DX质谱仪（美国AB Sciex公司），Shimadzu Nexera X2高效液相系统、Shim-pack GISSC液相色谱柱（日本岛津公司，1.9 μm，2.1 mm×50 mm），ZT-Ⅱ型细胞收集器（绍兴市卫星医疗设备制造有限公司），DSH-300A水浴恒温振荡仪（苏州培英实验设备有限公司），BE-9010微孔板恒温振荡器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司），5810R台式离心机（德国Eppendorf公司）。

1.2 方法

1.2.1 合成 IMPY与 IMPY-D参照文献合成IMPY，再按照图1合成IMPY的氘代产物IMPY-D。

图1 IMPY-D6的合成

1.2.2 建立IMPY及IMPY-D的LC-MS方法 按照IMPY及IMPY-D分子量，以二甲基亚砜为溶剂配制浓度为1×10mol／L溶液，再用80%乙腈（Milli-Q超纯水∶乙腈＝1∶4）稀释得到终浓度为1×10mol／L的工作液。……