UFC1在弥漫大B细胞淋巴瘤中的表达研究

田祖国 高陆 刘水玉 翁春岚

遵义医科大学附属医院血液内科（贵州遵义563000）

弥漫大B 细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）是非霍奇金淋巴瘤（Non-Hodgkin′s lymphoma，NHL）最常见的类型，其发病率占NHL 31% ～34%［1］，我国DLBCL 的发病率更高，统计显示我国DLBCL 占所有淋巴瘤的40.1%，占NHL 的45.8%［2］。联合免疫化疗显著改善DLBCL 疗效［3］，但由于DLBCL 具有高度异质性，仍有约40%的DLBCL 患者表现复发耐药导致治疗失败，而寻找新的靶标对DLBCL 的诊疗具有重要意义［4］。UFC1（ubiquitin-fold modifier conjugating enzyme 1，UFC1）是一个新鉴定的类泛素结合酶E2，有研究显示其在乳腺癌组织中明显高表达［5］。本研究应用免疫组化方法（immunohistochemical，IHC）检测DLBCL中UFC1 的表达情况，并联合应用多个生物数据库研究UFC1 在DLBCL 中的表达情况，分析UFC1 表达与DLBCL 的临床特征、生存预后的相关性，为DLBCL 的临床诊疗提供新的依据和潜在靶点。

1 资料与方法

1.1 组织标本免疫组化

1.1.1 标本收集收集遵义医科大学医学附属医院病理资料，筛选病例资料相对完整的40 例初治DLBCL 和20 例反应性淋巴结炎的病理组织石蜡标本，采用IHC 法检测UFC1 表达情况，组织标本均取自淋巴结肿块。纳入标准：（1）病理学明确诊断为DLBCL；（2）有完整的整体评估资料，包括ECOG 评分、LDH、影像检查、IPI 评分等；（3）完成规范的DLBCL 化疗疗程。排除标准：（1）非DLBCL 的其他类型淋巴瘤及肿瘤；（2）无完整的临床资料；（3）未治疗或者治疗不规范者。其中男性26 例，女性14 例；年龄≥60 岁19 例，＜60 岁21 例；AnnArbor分期Ⅰ-Ⅱ期8 例，Ⅲ-Ⅳ期32 例；ECOG 评分＜2 分25 例，≥2 分15 例；有B 症状16 例，无B 症状 的24 例；有结外浸润22 例，无结外浸润的18 例；IPI评分0 ～1 分10 例，2 分18 例，3 分10 例，4 ～5 分2 例。实验研究方案经过医院伦理委员会审核。

1.1.2 主要试剂Anti-UFC1 antibody（Ab-cam，ab189252），免疫显色试剂盒EnVisionTMFLEX+，Mouse，HighpH，（Link），DAKO，K800211）。

1.1.3 免疫组化染色石蜡切片按En Vision 两步法染色，由2 名病理科医师读片判断，采用免疫组化染色评分（immunoreactive score，IRS）进行判定，以阳性细胞数评分加染色强度评分之和进行综合评分。0 ～1 分为阴性，用（-）表示；2 ～3 分为低表达，用（+）表示；4 ～5 分为中表达，用（++）表示；6 ～7 分为高表达，用（+++）表示；（+）-（+++）均视为阳性表达。

1.2 GEPIA数据库利用GEPIA数据库［6］（GEPIA，http：//gepia.cancer-pku.cn/index.html）分析UFC1 在DLBCL 和正常组织中的差异表达，分析步骤：（1）Expression DIY 板块中选择Boxplot；（2）Gene 输入UFC1；（3）Datasets Selection 选择DLBC；（4）LogScale 选择否；（5）其余参数选项为默认。

1.3 GEO 数据集在GEO 数据库［7］（GEO，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中检索筛选DLBCL 数据集，分析UFC1 的差异表达，及UFC1 表达与DLBCL临床特征及生存预后相关性。

1.3.1 GSE9327 数据集GSE9327数据集［8］检测了反应性淋巴结炎（reactive lymphadenitis）和淋巴瘤基因表达差异，包含8 例反应性淋巴结炎和38例套细胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma，MCL）、38例慢性淋巴细胞白血病（chronic lymphocytic lymphoma，CLL）、9 例伯基特淋巴瘤（burkitt′s lymphoma，BL）、27 例脾边缘区淋巴瘤（splenic marginal zone lymphoma，SMZL）、36 例弥漫大B 细胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）及33 例滤泡淋巴瘤（follicular lymphoma，FL）；应用该数据集分析UFC1 在反应性淋巴结炎和包括DLBCL 的淋巴瘤中的表达变化。

1.3.2 GSE10846 数据集GSE10846数据集［9］包含采用R-CHOP 方案治疗233 例DLBCL 的UFC1 基因表达值及患者的性别、年龄、临床分期、结外浸润及生存时间等临床信息。基于该数据集探讨UFC1 表达与DLBCL 临床特征及生存预后相关性。

1.4 OSdlbcl 数据库运用OSdlbcl 数据库［10］（OSdlbcl，http：//bioinfo.henu.edu.cn/DLBCL/DLBCLList.jsp）检索UFC1 表达与DLBCL 预后关系。分析步骤：（1）Gene symbol：UFC1；（2）Data Source：TCGA；（3）Survival：PFS，OS；（4）Split patients by：Upper 50%；（5）其余参数均选择All。

1.5 Linkedomics 数据库应 用Linkedomics 数据 库［11］（LinkedOmics，http：//linkedomics.org）分 析DLBCL 中UFC1 的共表达基因及GSEA 富集分析。分析步骤：（1）肿瘤类型为TCGA_DLBC；（2）选择RNAseq 数据；（3）输入基因名称UFC1；（4）目标分析数据为RNAseq；（5）选择Pearson Correlation检验。

1.6 String-DB 数据库运 用String 数据 库［12］（String，https：//string-db.org）分析UFC1 蛋白互作关系。分析步骤：（1）输入基因：UFC1；（2）物种：Homo sapiens；（3）置信度：Medium 0.4；（4）最大相互作用：20。

1.7 统计学方法应用SPSS 25.0 进行统计分析，组织UFC1 免疫组化结果采用秩和检验；数据集GSE9327 基因表达差异分析采用Graphpad Prism 8.0 分析及作图；数据集GSE10846 资料临床特征分析采用卡方检验；生存分析采用Graphpad Prism 8.0 分析及作图；P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 组织免疫组化组织染色显示UFC1主要在细胞质中阳性表达，部分细胞核有少量阳性表达。UFC1 蛋白在40 例DLBCL 和20 例reactive lymphadenitis 组织中IHC 检测呈+、++、+++表达的镜下表现如下（图1）。DLBCL中UFC1蛋白呈-、+、++、+++者分别为0、4、16、20 例；反应性淋巴结炎中UFC1 蛋白呈-、+、++、+++者分别为3、14、2、1 例；UFC1 表达在DLBCL 和反应性淋巴结炎中差异有统计学意义（P＜0.001，表1）。

图1 淋巴结组织中UFC1 蛋白的表达（10×40）Fig.1 Positive Expression of UFC1 protein in lymph node samples（10×40）

表1 UFC1 表达在DLBCL 和反应性淋巴结炎中的表达Tab.1 UFC1 expression in patients with DLBCL and Reactive lymphadenitis例

2.2 数据库中UFC1 在淋巴瘤中的表达

2.2.1 GEPIA 检索UFC1 在DLBCL 中的表达GEPIA 结果显示47 例DLBCL 和337 例正常组织的UFC1 表达明显差异，DLBCL 中UFC1 表达异常升高，差异有统计学意义（P＜0.01，图2）。

图2 GEPIA 在线分析显示DLBCL 中UFC1 表达显著高于正常组织Fig.2 UFC1 expression in DLBCL was significantly higher than normal tissues by GEPIA analysis

2.2.2 GEO 数据库中UFC1 的表达GSE9327 数据集分析显示，与反应性淋巴结炎相比，在DLBCL中UFC1 基因表达明显升高（P＜0.0001），同时在MCL、MZL、CLL、BL 中，UFC1 基因表达也明显升高，但在滤泡淋巴瘤中表达不升高（图3）。

图3 GSE9327 数据集分析显示UFC1 在DLBCL、MCL、MZL、CLL、BL 中呈高表达Fig.3 UFC1 is highly expressed in DLBCL，MCL，MZL，CLL and BL in GSE9327

2.3 UFC1 表达与DLBCL 的临床特征相关性GSE10846 数据集分析显示在DLBCL 患者中，UFC1在大于60 岁老年患者（P= 0.003）和non-GCB 型DLBCL 中表达更高（P= 0.015），而在患者性别、LDH、结外浸润、临床分期及ECOG 评分中差异无统计学意义（表2）。

2.4 UFC1 表达与DLBCL 预后相关性

2.4.1 GEO 数据库分析GSE10846 数据集分析显示UFC1 高表达的DLBCL 患者总生存期（overall survival，OS）明显差于UFC1 低表达患者，差异有统计学意义（P=0.0326，图4）。

表2 GSE10846 中UFC1 表达与DLBCL 患者临床病理特征的关系Tab.2 Association between UFC1 expression and clinicopathological characteristics in GSE10846例（%）

图4 GSE10846 分析显示UFC1 高表达的DLBCL 患者OS较差Fig.4 The OS of DLBCL patients with high expression of UFC1 was inferior（P=0.032 6）in GSE10846

2.4.2 OSdlbcl中检索UFC1表达与DLBCL预后相关性在线数据库OSdlbcl 中检索结果显示UFC1高表达的DLBCL 患者的无进展生存期（progression free survival，PFS）差于UFC1低表达患者（P=0.015 9），同样的UFC1 高表达DLBCL 患者其OS 也比较差（P= 0.0325），提示DLBCL 患者UFC1 高表达者预后不良（图5）。

图5 OSdlbcl 分析显示高表达UFC1 与DLBCL 预后不良相关，其PFS（A）、OS（B）均较短Fig.5 High expression of UFC1 indicate poor prognosis in patients with DLBCL according to OSdlbcl.Patients with high expression of UFC1 had shorter PFS（A）and OS（B）

2.5 UFC1共表达基因分析Linkedomics分析显示，1 779个基因（暗红点）与UFC1呈正相关，2 478个基因（暗绿点）与UFC1 呈负相关（false discovery rate，FDR ＜0.01，图6A）。与UFC1正相关和负相关的前50个显著基因热图显示（图6B、C）。UFC1共表达基因GO（Gene Ontology，GO）分析（图6D）显示主要涉及内质网蛋白定位、核糖体基因表达、线粒体呼吸链复合体、NADH 脱氢酶复合体翻译启动及翻译延伸、细胞膜蛋白定位等；KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析显示（图6E）其主要富集在核糖体、氧化磷酸化、蛋白酶体、及癌症miRNA、Hedgehog信号通路、JAK-STAT信号通路等。

图6 DLBCL 中的UFC1 共表达基因分析结果Fig.6 UFC1 co-expression gene analysis in DLBCL

2.6 UFC1蛋白互作分析String数据库检索UFC1的PPI 分析结果（富集系数为0.803；P值为8.22 ×10-15）显示（图7）：与UFC1 相互作用密切的包括：PCMT1、COX17、UFSP1、UFSP2、USP34、USP9X、YKT6、SPR、TYMS、UBA3、UBA5、UFL1、ATP6V1B2等。

3 讨论

DLBCL 是NHL 中最常见的类型，联合免疫化疗明显提高了DLBCL 患者的生存预后，但仍然有相当一部分患者疾病复发。泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system，UPS）介导细胞内泛素化的蛋白质经蛋白酶体降解，可高效并高选择性地降解细胞内蛋白质，如细胞周期调节蛋白、癌基因和抑癌基因产物等，与血液系统恶性肿瘤的发生、发展密切相关［13］；如UBCH10 在霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B 细胞淋巴瘤、外周T 细胞淋巴瘤及伯基特淋巴瘤中均过度表达［14］。自1975年发现泛素和20 世纪80年代初发现泛素级联以来，许多泛素样蛋白（UBLs）被鉴定为翻译后修饰因子，目前已经鉴定出17 种9 大类的类泛素蛋白：包括NEDD8、SUMO、ISG15、FUB1、FAT10、Atg8、Atg12、Urm1 和UFM1 等；研究显示类泛素蛋白Atg8（或LC3）与介导细胞自噬相关，涉及Atg7、Atg3、Atg12/5/16L、Atg4A 等，研究显示LC3 与Atg5 相互协同促进胃癌发生发展［15］，而Atg4A 的过表达促进胃癌细胞的EMT 作用，增强胃癌细胞的侵袭和转移［16］；而以NEDD88 为靶点的酶抑制剂Pevonedistat 在淋巴瘤细胞中具有抗肿瘤活性，临床研究也提示其在复发难治淋巴瘤治疗有效［17］。

UFC1 定位于1 号染色体，为新鉴定的类泛素结合酶E2，属于类泛素Ufm1 修饰系统（ubiquitinfold modifier 1，Ufm1）。研究发现UFC1 在乳腺癌组织和细胞系中高表达［18］，而沉默UFC1 抑制了乳腺癌细胞的多种生物学活性，UFC1 可以通过miR-34a/CXCL10 轴调控乳腺癌的生物学活性［19］。提示UFC1 基因与恶性肿瘤的发生和发展有着密切关系。

本研究首先通过IHC 检测显示UFC1 蛋白在DLBCL 中表达明显高于反应性淋巴结炎（P＜0.001）；进一步的GEO 数据验证发现UFC1 不仅在DLBCL 患者中表达明显升高，同时在其他恶性淋巴瘤包括BL、MZL、MCL 及CLL 中均呈明显高表达。

图7 UFC1 蛋白互作网络Fig.7 UFC1 protein interaction network

进一步的GEO 数据分析发现UFC1 表达与DLBCL 患者年龄和Hans 分型相关，在老年患者和non-GCB 类型的DLBCL 中表达更高，而与DLBCL患者的性别、结外浸润、临床分期、ECOG 评分及LDH 表达未发现明显相关性。而已有的研究已经明确老年的DLBCL 患者和non-GCB 类型患者预后均相对不佳，推测UFC1 的异常表达可能与DLBCL患者预后相关。通过GEO 数据集GSE10846 分析证实UFC1 的表达与DLBCL 患者预后是相关的，UFC1 高表达患者的OS 明显差于UFC1 低表达患者（P= 0.0326）；而OSdlbcl 数据库检索分析也证实了UFC1 高表达的DLBCL 患者PFS（P=0.0159）、OS（P=0.0325）均明显差于UFC1 低表达患者，提示高表达UFC1 的DLBCL 患者预后不良。

UFC1 共表达基因富集分析结果与核糖体、氧化磷酸化及多种肿瘤癌症通路相关，而研究显示核糖体、氧化磷酸化等与肿瘤发生、发展密切相关，均可能为新的肿瘤治疗潜在靶点［20-21］。UFC1蛋白互作分析显示其与其与多种肿瘤标志物密切相关，包括PCMT1、COX17、UFSP1、UFSP2、USP34、USP9X、DDRGK1、YKT6、SPR、TYMS、UBA3、UBA5、UFL1、ATP6V1B2 等，而已有研究显示PCMT1、USP9X、UBA5、DDRGK1 等［22-25］与肿瘤发生、发展明显相关，是肿瘤的潜在治疗靶点。

根据以上研究分析结果，UFC1 在DLBCL 淋巴瘤中表达异常增高，在老年患者和non-GCB 患者中表达升高明显，高表达UFC1 的DLBCL 患者预后不良，UFC1 与多种肿瘤相关基因及肿瘤通路密切相关，有可能成为淋巴瘤的潜在治疗靶点。