益气通窍活血方对颅脑损伤模型大鼠认知功能和神经功能缺损的作用及机制探讨

杨 琳，王 丽，王 晨，王立新

(陕西中医药大学附属西安市中医医院，陕西 西安 710021)

颅脑损伤系指因钝性创伤或机械力创伤造成脑功能暂时或永久性损害的神经系统损伤性疾病，是神经外科的常见病症，神经功能缺损是其重要临床表现[1]。根据发生时间的先后，颅脑损伤分为原发性和继发性两个病理阶段。原发性颅脑损伤发生在受伤当即，是外力直接作用于头部引发的脑组织损伤；继发性损伤则发生于原发性损伤后，主要因脑组织缺氧缺血、脑水肿、氧化应激损伤、炎症反应、细胞凋亡、细胞钙超载、线粒体功能障碍等因素导致，可持续数周，是诱发颅脑损伤进一步发展加重的重要原因，也是造成颅脑损伤高致残率和高病死率的重要原因[2-3]，因此减轻继发性脑损伤对颅脑损伤的治疗和预后有重要意义。颅脑损伤属于中医学“头部内伤”“瘀血证”范畴，病机主要为瘀血内阻、正气受损，因此治疗以益气活血、通窍化瘀为主。有研究报道，清代王清任调配的通窍活血汤可以减轻重型颅脑损伤的继发性炎症反应[4]。益气通窍活血汤是我院在通窍活血汤的基础上制定的协定处方，临床上应用可改善颅脑损伤引起的认知功能和神经功能障碍，但其作用机制尚不明确。本研究通过建立颅脑损伤大鼠模型，采用益气通窍活血方干预，旨在探讨益气通窍活血方对颅脑损伤后认知功能和神经功能缺损的影响及其作用机制。

1 实验材料与方法

1.1动物 60只清洁级雄性SD大鼠，7～8周龄，体质量(250±20)g，由陕西中医药大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(陕)2012-007，动物质量合格证号：0018209。室温饲养，自由饮水进食，符合《实验动物管理条件》要求。

1.2药品与试剂 益气通窍活血方组成：黄芪15 g、党参15 g、当归9 g、川芎9 g、赤芍6 g、桃仁12 g、红花9 g、柴胡3 g、丹参9 g、甘草6 g、人工麝香0.15 g；饮片均由本医院药房提供并煎煮，药材加水煎煮2次，合并药液。水合氯醛(分析纯，天津市瑞金特化学品有限公司)；苏木精-伊红染色液(武汉华美生物工程有限公司)；神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)试剂盒购于南京建成生物工程研究所；S100B蛋白试剂盒购于武汉博士德生物技术有限公司； 兔抗NGF-β购自美国Santa Cruz公司；Bcl-2、Bax抗体购自美国 Santa Cruz 公司；Envision试剂(HRP/Rabbit)即用型购自丹麦Dako公司。

1.3仪器 Pin Point TM 精密颅脑损伤撞击器(Hat-teras Instruments，美国)；RM2235型病理切片机(德国莱卡公司)；TE2000-E倒置显微镜(尼康仪器有限公司)；高速低温离心机(北京京立离心机有限公司)；OLYMPUSAU5400全自动生化分析仪(日本奥林巴斯有限公司)；ELx800酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)。

1.4实验方法 将60只大鼠随机分为空白组、假手术组、模型组、益气通窍活血低剂量组、益气通窍活血中剂量组、益气通窍活血高剂量组，每组10只。建模前4 h禁食水，除空白组外，其余组大鼠腹腔注射10%水合氯醛400 mL/kg行全身麻醉，无菌条件下沿头皮正中矢状切开，分离骨膜，暴露颅骨，在颅骨冠状缝后1.5 mm、中线偏左2.5 mm处开一直径5 mm的骨窗，手术过程中确保硬膜的完整性。模型组和益气通窍活血各剂量组大鼠固定于定位仪上，将撞击锤安置于骨窗，选用直径5 mm的撞针，设定撞击深度5 mm，速度2 vm/s，接触时间90 ms，术后修补骨窗，缝合伤口。假手术组不进行撞击，仅打开骨窗，再修补缝合。造模后采用改良神经功能缺损评分(mNSS)法对大鼠进行神经功能缺损评估，造模后6 h mNSS评分>4分表示建模成功[5]。模型组和益气通窍活血高剂量组各死亡1只，益气通窍活血中剂量组死亡2只。建模成功后，益气通窍活血低、中、高剂量组分别给予益气通窍活血方2.5 mg/kg、5 mg/kg、7.5 mg/kg灌胃，其余组给予生理盐水灌胃，均 1次/d，连续7 d。

1.5观察指标与方法

1.5.1mNSS评分 分别于造模后24 h、72 h、168 h对各组大鼠进行mNSS评分。mNSS评分由运动(肌肉状态、异常运动)、感觉(视觉、触觉和本体感受)和反射测试构成，分值0～18分，得分越高，神经功能损伤越严重。

1.5.2认知功能 采用Morris水迷宫试验对大鼠认知功能(空间学习、空间探索能力)进行评估。Morris水迷宫：直径180 cm、高60 cm圆形水池，池中有直径20 cm的圆形透明平台和数据采集分析系统。①空间学习能力测试：于建模成功后第4天开始对大鼠进行为期4 d、每日4次、每次间隔20 min的航行训练，水温室温，从水池4个边缘随机位置放入大鼠，以大鼠找到低于水面1 cm的圆形透明平台或航行时间达120 s但未能找到平台视为结束。计算大鼠每日抵达平台的平均航行时间即为逃避潜伏期，逃避潜伏期越长表示认知功能越差。②空间探索测试(记忆力测试)：所有大鼠在造模第7天时测试记忆力，撤去圆形透明平台，从水池4个边缘随机位置放入大鼠，航行时间60 s，记录大鼠穿越原平台的次数，测试2次，间隔15 min 1次，取平均值。

1.5.3血清S100B、NGF、BDNF水平 于建模后第7天，10%水合氯醛麻醉，心脏取血，离心，取上层血清，采用放射免疫法检测血清S100B、NGF、BDNF水平，严格按说明书操作。

1.5.4脑组织病理表现 于建模后第7天，取血后主动脉灌注生理盐水200 mL，至心脏右心耳处流出清亮液体，再灌注4%多聚甲醛250 mL，断头取脑，置于4%多聚甲醛中固定24 h。石蜡包埋切片，行HE染色和尼氏染色，镜下观察脑组织神经元细胞病理形态学。

1.5.5脑组织中Bcl-2及Bax蛋白表达情况 选取制备好的石蜡包埋切片，常规脱蜡脱水，PBS漂洗3次，3 min/次；滴加0.3% H2O2，室温静置15～20 min，PBS漂洗3次；滴加20%正常山羊血清封闭液，室温孵育30 min；滴加Ⅰ抗，Bcl-2和Bax按照一定浓度稀释，室温孵育10～15 min，4 ℃过夜，37 ℃复温30 min，PBS漂洗3次，5 min/次；滴加Envision 试剂(HRP/R)，37 ℃孵育30 min，PBS洗3次，5 min/次。DAB显色8～12 min；苏木素复染，热水蓝化；脱水，透明，树脂封片；烤片，拍照。Bcl-2和Bax蛋白染色呈棕黄色或黄色为阳性细胞，在高倍镜下每张切片随机选取5个视野，计算脑组织中Bcl-2和Bax阳性细胞表达数，取平均值为最终结果。

2 结 果

2.1各组大鼠不同时间mNSS评分比较 空白组与假手术组大鼠术后24 h、72 h、168 h的mNSS评分比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。与空白组比较，模型组术后24 h、72 h、168 h的mNSS评分均明显升高(P均<0.05)；与模型组比较，益气通窍活血各剂量组大鼠术后24 h、72 h、168 h的mNSS评分均明显降低(P均<0.05)；益气通窍活血高剂量组大鼠术后24 h、72 h、168 h的mNSS评分均明显低于益气通窍活血低剂量组(P均<0.05)，益气通窍活血低剂量组与中剂量组、中剂量组与高剂量组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠不同时间mNSS评分比较分)

2.2各组大鼠认知功能比较 空白组与假手术组大鼠的逃避潜伏期、穿越平台次数比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。与空白组比较，模型组大鼠的逃避潜伏期明显延长(P<0.05)，穿越平台次数明显减少(P<0.05)；与模型组比较，益气通窍活血各剂量组大鼠的逃避潜伏期明显缩短(P均<0.05)，穿越平台次数明显增加(P均<0.05)；与益气通窍活血低剂量组比较，益气通窍活血高剂量组大鼠的逃避潜伏期更短(P<0.05)，穿越平台次数更多(P<0.05)；益气通窍活血低剂量组与中剂量组、中剂量组与高剂量组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠逃避潜伏期和穿越平台次数比较

2.3各组大鼠血清S100B、NGF、BDNF水平比较 空白组与假手术组大鼠血清S100B、NGF、BDNF水平比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。与空白组比较，模型组大鼠血清S100B水平明显升高(P<0.05)，NGF、BDNF水平均明显降低(P均<0.05)；与模型组比较，益气通窍活血各剂量组大鼠血清S100B水平均明显降低(P均<0.05)，NGF、BDNF水平均明显升高(P均<0.05)；与益气通窍活血低剂量组比较，益气通窍活血高剂量组大鼠血清S100B水平更低(P<0.05)，NGF、BDNF水平更高(P均<0.05)；益气通窍活血低剂量组与中剂量组、中剂量组与高剂量组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表3。

表3 各组大鼠血清S100B、NGF、BDNF水平比较

2.4各组大鼠脑组织病理学表现 空白组与假手术组大鼠脑组织皮质结构正常，无出血、水肿及损伤，各细胞层次分明清晰，排列整齐有序，神经元核仁清楚，血管正常无扩张。模型组大鼠创伤灶及其周边组织发生明显水肿，神经元和胶质细胞胞体出现肿胀，可见细胞核固缩及缺失，炎性细胞浸润。益气通窍活血各剂量组大鼠创伤区及周围组织水肿显著减轻，神经细胞肿胀减少，核固缩好转，偶见部分空泡中央细胞缺失，炎性细胞浸润减轻，其中以高剂量组改善最佳。见图 1。

图1 各组大鼠脑组织病理学HE染色镜下表现(×400)

2.5各组大鼠脑组织中Bcl-2、Bax蛋白表达情况比较 空白组与假手术组大鼠脑组织中Bcl-2、Bax阳性细胞表达数比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。与空白组比较，模型组大鼠脑组织中Bcl-2、Bax阳性细胞表达数均明显增多(P均<0.05)；与模型组比较，益气通窍活血各剂量组大鼠脑组织中Bcl-2阳性细胞表达数均明显增多(P均<0.05)，Bax阳性细胞表达数均明显减少(P均<0.05)；与益气通窍活血低剂量组比较，益气通窍活血高剂量组大鼠脑组织中Bcl-2阳性细胞表达数更多(P<0.05)，Bax阳性细胞表达数更少(P<0.05)；益气通窍活血低剂量组与中剂量组、中剂量组与高剂量组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表4。

表4 各组大鼠脑组织中Bcl-2、Bax阳性细胞表达数比较个)

3 讨 论

颅脑损伤为神经外科的一种常见外伤，常出现大脑学习能力和记忆力减退等认知功能障碍[6-7]，预后多不佳。在颅脑损伤的发生发展过程中，继发性颅脑损伤的发生起到重要作用，并严重影响患者预后[8]。脑损伤后，各种刺激信号可激活多种病理生理因子表达，从而诱导神经细胞凋亡，细胞凋亡是继发性颅脑损伤的重要机制[9]。神经细胞凋亡与颅脑损伤的严重程度呈正相关，与神经功能缺损也密切相关[10]。细胞凋亡受多种基因调控，Bcl-2和Bax被认为是关键基因[11]，其中Bcl-2为抑制凋亡基因，其通过抑制诱导因子被激活、减少自由基、抑制脂质过氧化反应、提高神经细胞对缺氧的耐受性，从而发挥作用；Bax则是Bcl-2的拮抗蛋白，与Bcl-2的作用正相反，为促凋亡基因，通过拮抗Bcl-2的功能促进神经细胞凋亡。因此维持Bcl-2和Bax蛋白表达平衡对调控神经细胞凋亡有重要意义[12]。

海马区是脑边缘系统中的重要结构，主管人的学习和记忆能力、认知功能等，当其受损后会表现出学习和记忆能力的下降，这也是颅脑损伤的典型标志之一。NGF是最早发现的一类神经营养因子，对神经元的发育、成熟具有促进作用，并能调节神经纤维的生长方向。当脑组织受损时，NGF能促进神经纤维生长，保护损伤神经元，从而减轻继发性颅脑损伤。BDNF是在脑内合成的一种内源性脑神经营养因子，主要在中枢神经系统内表达，分布于脑皮质、纹状体区、海马区，对神经元的分化和生长再生具有维持和促进作用。在脑损伤早期，BDNF释放量会显著增加，以保护神经功能[13]；但后期，当损伤神经元的因素持续且大量存在时，会过度消耗BDNF，同时还能抑制BDNF合成，导致生物体内BDNF水平降低。S100B蛋白酸性钙结合蛋白是一种特异性脑蛋白，主要分布于神经系统星形胶质细胞、垂体前叶细胞。当星形胶质细胞损伤时，S100B蛋白的释放量会明显增加，并进一步刺激星形胶质细胞、小胶质细胞产生大量炎性因子及NO，诱导神经细胞凋亡而损伤神经功能，S100B蛋白水平的高低与颅脑损伤的程度密切相关[14]。因此，提高NGF、BDNF水平对减轻脑损伤后期神经元损伤和抑制神经细胞凋亡，恢复大脑认知功能有重要意义。

中医学认为，“脑为元神之府”，人的感官、思维、意识和记忆力等皆由脑统摄。外伤导致颅脑损伤可使机体对外界的认识程度、感知水平和适应能力下降[15]。颅脑损伤的病位在脑，病机为瘀血内阻、正气受损，气化运行不顺则为风，风动生热，伤及脑髓经络，因此益气活血、祛风通络是基本的治疗准则[16]。本研究中所用益气通窍活血方以黄芪、党参为君药，益气固表、补气升阳，气血充盈利于活血通络；川芎有血中之气药之称，具有活血行气、消散瘀血、祛风止痛的功效，能上达巅顶、下通气海；当归活血补血；红花、桃仁、赤芍活血化瘀；柴胡祛除风邪；甘草补脾益气、调和诸药。现代药理研究发现，方中多药均具有抗炎、抗氧化、清除自由基、扩张脑血管、抑制血小板活化等作用，如川芎嗪能清除自由基、降低氧化应激反应、减轻炎症反应、抑制血小板聚集等；丹参能减轻炎症因子对脑神经细胞的损伤，并促进组织修复再生，恢复神经功能；黄芪多糖、柴胡可增强免疫功能、清除自由基等；甘草具有糖皮质激素样作用；红花、桃仁可扩张血管，抑制血小板黏附聚集[17-20]。因此，该方能抑制血小板聚集，有效改善脑部微循环，增加脑血流量，同时还能减轻炎性反应，清除氧自由基，减少神经细胞凋亡，修复和保护损伤脑组织，改善认知功能障碍。

本实验结果显示，与模型组比较，益气通窍活血各剂量组大鼠术后各时间点的mNSS评分及血清S100B水平均明显降低，血清NGF、BDNF水平均明显升高，水迷宫试验逃避潜伏期明显缩短、穿越平台次数明显增多，脑组织中Bcl-2阳性细胞表达数均明显增多，Bax阳性细胞表达数均明显减少，且益气通窍活血高剂量组各指标改善最明显。表明益气通窍活血方对颅脑损伤大鼠有较好的干预作用，能有效保护损伤神经元，减轻神经功能缺损，改善认知功能，机制可能与提高NGF、BDNF水平，降低S100B水平，抑制Bax蛋白表达，减少神经细胞凋亡有关。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。