拟穴青蟹CYP302a1基因的克隆及表达模式分析

张林姿，赵 明，张凤英，王 伟，刘志强，马春艳，谌 微，王 珂，马凌波

（1.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306；2.中国水产科学研究院东海水产研究所，农业农村部远洋与极地渔业创新重点实验室，上海 200090）

节肢动物中，周期性蜕皮对节肢动物的生长、繁殖和形态发生起着重要作用。周期性蜕皮受到多种环境和自身因素的影响，其中最主要的是由类固醇激素浓度控制，而蜕皮激素（ecdysone，Ecd）是最重要的类固醇激素［1-3］。蜕皮激素首先由BUTENANDT和KARLSON［4］1954年从蛾蛹中分离得到，随后Ecd的化学结构也被阐明［5］。昆虫中蜕皮激素的主要活性形式是20-羟基蜕皮酮（20-hydroxyecdysone，20E），其诱导和调节蜕皮周期中一系列生命进程的变化［1］。1965年HUBER和HOPPE［5］发现前胸腺为Ecd的主要分泌合成器官，现已证明，节肢动物周期性蜕皮主要是由类固醇蜕皮激素的周期性波动调节的［6-7］。此外，Ecd的浓度变化也与再生、变态、卵子发生等［8-13］密切相关。因此，对Ecd的代谢调控研究具有重要意义。

甲壳动物的Ecd主要由Y器官（Y-organ，YO）合成分泌［14］，其合成与昆虫类似。Ecd的合成可以分为两个阶段：首先，食物中的胆固醇在肠道吸收后，通过血淋巴运输到YO，胆固醇在Neverland基因、“黑盒子”（包括CYP307a1/CYP307a2）基因编码酶的作用下催化成为5βdiketol（3D2，22，25dE），此过程在所有十足目物种中保持一致［15］；然后，5β-diketol在多种细胞色素 P450 （包 括 CYP306Al、CYP302Al 和CYP315Al）的催化下转化为Ecd。随后，Ecd释放到外周组织，由20-羟化酶（CYP314A1）催化而成其主要的活性形式 20-羟基蜕皮酮（20-hydroxyecdysone，20E）［16-17］。

CYP302A1催化C22的羟基化，是Ecd合成通路中的重要催化酶。在果蝇（Drosophila melanogaster）中通过敲除CYP302a1（dib）基因获得的dib突变胚胎，发现其Ecd和20E滴度非常低，且通过表型分析发现dib突变胚胎在一些后期形态发生过程存在严重缺陷，如头部退化及肠发育异常等，证明CYP302a1基因在蜕皮激素合成中起重要作用［18］；……