不同产地大黄中游离蒽醌和结合蒽醌的含量测定

王红娟，王 芳，吕小旭，张旭东，马 伟

(1甘肃医学院·甘肃 平凉 744000；2平凉旭阳科技有限责任公司·甘肃 平凉 744000)

大黄又名川军、将军、黄良等，是一种多年生草本植物，2015版《中国药典》规定大黄为蓼科多年生草本植物掌叶大黄(RheumpalmatumL)、唐古特大黄(RheumtanguticumMaxim.ex Balf)或药用大黄(RheumofficinaleBaill)的干燥根和根茎[1]。掌叶大黄和唐古特大黄被称为“北大黄”，主要产于青海和甘肃等地，药用大黄称为“南大黄”，主要产于四川和陕西等地[2]。大黄性寒味苦，归脾、胃、大肠、肝、心包经，具有清热解毒、攻下、活血等功效。经现代药理学研究表明其所含结合蒽醌具有致泻作用，游离蒽醌具有抑菌抗炎等功效；除此之外，还可用于消化系统和循环系统，可以调节机体的胃肠道功能，保护心血管作用，抗肿瘤和调节免疫功能[3]。本文主要选取不同产地的大黄，根据《中国药典》记载的测定方法，进行测定大黄中游离蒽醌和结合蒽醌的含量，为大黄产地的优选和质量提供依据。

1 实验材料

1.1 药物 大黄素对照品：上海如吉生物科技，批号：180810；青海西宁大黄：西宁市康美中药城；河北安国大黄：河北安国药材市场；甘肃华亭大黄：华亭市马峡乡碾盘子村；甘肃平凉大黄：平凉市崆峒山后山；甘肃岷县大黄：甘肃省定西市岷县麻子川；甘肃宕昌大黄：宕昌县；甘肃礼县大黄：甘肃鑫晟源生物科技有限公司，批号：19081609；甘肃武威大黄：武威市古浪县大靖镇；安徽亳州大黄：亳州市佳旭药业有限公司，批号：18041363。

1.2 仪器 SP-1920型双光束紫外分光光度计：上海光谱仪器有限公司；KDM型可调温式电热套：山东鄄城光明仪器有限公司；DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器：巩义市予华仪器有限公司；RE-S2型旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；FA2004B型电子分析天平：上海越平科学仪器有限公司；KQ-100DE型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；DG160C型一斤装中药材粉碎机：浙江省瑞安市飞达药材器械厂；SP-756P紫外可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司制造。

1.3 试剂 甲醇(分析纯)：天津市大茂化学试剂厂；醋酸镁(分析纯)：天津市大茂化学试剂厂；三氯甲烷(分析纯)：天津市耀华化学试剂有限公司；水为蒸馏水。

2 方法

2.1 对照品溶液的配制 用大黄素作为对照品，0.5%醋酸镁甲醇溶液作为显色剂，精密称定大黄素对照品20.00 mg，置25 mL容量瓶中，加0.5%醋酸镁甲醇溶液至刻度线，然后摇匀，即得0.8 g/L的大黄素对照品溶液[4]。

2.2 供试品的制备

2.2.1 结合蒽醌供试液的制备 依据《中国药典》的方法[1]，精密称定大黄粉末(过四号筛)约0.5 g，置具塞锥形瓶中，精密量取甲醇50 mL，加入到具塞锥形瓶，称定其总重量，水浴加热回流1 h，放冷至室温后，称定其重量，再用甲醇补足冷凝回流时被挥发掉的甲醇，摇匀后用普通滤纸过滤。精密量取续滤液5 mL，置烧瓶中然后挥干甲醇，加8%HCL溶液10 mL，超声处理3 min，再加三氯甲烷10 mL，冷凝回流1 h，放冷至室温，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，振荡摇匀，静置5 min，分离出三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取4次，每次6 mL，合并三氯甲烷液，转移至50 mL容量瓶中，并定容至刻度线，摇匀，精密量取2 mL溶液，置10 mL容量瓶中，挥干三氯甲烷，加0.5%醋酸镁甲醇溶液至刻度线，摇匀，在紫外下测定其吸光度，根据标准曲线中的线性方程计算其含量。

2.2.2 游离蒽醌供试液的制备 依据《中国药典》的方法[1]，精密称定大黄粉末(过4号筛)约0.5 g，置具塞锥形瓶中，精密量取甲醇50 mL，加入到具塞锥形瓶，称定其总重量，水浴加热回流1 h，放冷至室温，再称定其重量，再用甲醇补足冷凝回流时被挥发掉的甲醇，摇匀后用普通滤纸过滤，取续滤液2 mL，置10 mL 容量瓶中，挥干三氯甲烷，加0.5%醋酸镁甲醇溶液至刻度线，摇匀，在紫外下测定其吸光度A，根据标准曲线中的线性方程计算其含量。

2.3 波长的选择 精密量取对照品溶液0.3 mL，置25 mL容量瓶中，加0.5%醋酸镁甲醇溶液至刻度线，摇匀，以0.5%醋酸镁甲醇溶液作为空白对照，依照紫外-可见分光光度法，在200～700 nm波长范围内扫描。结果表明蒽醌类成分在514 nm处有最大吸收，所以测定波长选择在514 nm处。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 精密量取大黄素对照品溶液适量，加0.5%醋酸镁甲醇溶液制成浓度分别为1.92、6.40、9.60、12.80、16.00、19.20、22.40 mg/L的大黄素对照品溶液。以0.5%醋酸镁甲醇溶液为空白对照，测定各溶液在514 nm波长处的吸光度，并以浓度C(mg/L)为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。计算得回归方程为：Y=0.0418X-0.0733(R2=0.9964)。结果显示配置的大黄素对照品溶液在浓度为1.92～22.4 mg/L范围内有良好的线性关系，其标准曲线见图1。

图1 对照品标准曲线

2.4.2 精密度试验 取对照品溶液(12.68 mg/L)，在514 nm波长处，测定其吸光度，RSD=0.25%(n=6)。说明该仪器精密度较好。

2.4.3 稳定性试验 精密称定礼县大黄(过4号筛)两份，每份约0.5 g，按照“2.2”项下方法,制备供试品，以0.5%醋酸镁甲醇溶液作为空白对照，分别在0、20、40、60、80、100、120 min测定514 nm处的吸光度。结果为游离蒽醌的RSD为1.81%，结合蒽醌的RSD为1.86%。表明样液在2 h内基本稳定。

2.4.4 重复性试验 将“2.2.1”和“2.2.2”项下供试品溶液各制备6 份，以0.5%醋酸镁甲醇溶液为空白对照，在514 nm波长处平行测其吸光度，计算大黄样品的游离蒽醌和结合蒽醌的平均含量分别为0.634%和7.28%，其RSD分别为2.90%和1.44%，则该方法重复性较好。

2.4.5 结合蒽醌加样回收率试验 精密称定，礼县大黄粉末(结合蒽醌的含量为7.28%)3份，每份约0.3 g。另精密称定，大黄素对照品10.4、16、20 mg，将此3份对照品分别加入3份样品中[5]，按照“2.2.1”项下方法制备供试品并测其吸光度。计算回收率。平均回收率99.44%(RSD=1.41%)。

3 样品测定结果

取各地区大黄药材粉末(过4号筛)各12份，每份约0.5 g。按照“2.2”项下供试品的制备方法，制备结合蒽醌供试液和游离蒽醌供试液各6份，分别测定其吸光度，计算蒽醌的含量，结果见表1。从结果可以看出，游离蒽醌产地最高的是甘肃宕昌大黄，其达到0.668%。结合蒽醌产地最高的是甘肃宕昌和甘肃礼县大黄，均达到7.30%以上。

表1 不同产地大黄中结合蒽醌、游离蒽醌含量测定结果

4 讨论

本文应用紫外-可见分光光度法对不同地区的大黄中游离蒽醌和结合蒽醌进行含量测定。该测定方法相对来说比较成熟稳定，且简单易行，成本低[6]。各地区大黄蒽醌类成分的含量有所不同，主要与其生长的海拔、光照、年限等条件引起其蒽醌含量发生改变[7]。通过对测定结果分析总结，发现甘肃宕昌县和甘肃礼县的大黄蒽醌类成分的含量比较高，其中游离蒽醌类成分的含量高达0.668%，结合蒽醌类成分含量高达7.38%，与文献研究结果相符[8-9]；可以对甘肃宕昌县和甘肃礼县大黄进行进一步的开发和利用。