罗非鱼罗湖病毒实时荧光RT-LAMP检测方法的建立

刘助红，张璜，唐玲，刘贤旭，林洁文，吴林

（1.广东科贸职业学院，广东 广州 510430；2.广州双螺旋基因科技有限公司，广东 广州 510005；3.暨南大学，广东 广州 510632）

罗非鱼（又名非洲鲫鱼）蛋白质含量高、少刺而深受消费者喜爱，被世界粮农组织（FAO）称作未来动物性蛋白质的主要来源[1-3]，是世界水产业重点研究和养殖的淡水鱼类之一。与其他鱼类相比，罗非鱼抗病力强，更容易养殖，自引入我国后，罗非鱼的养殖业得到了飞速发展，养殖产量逐年增长，目前已成为世界罗非鱼生产大国和出口大国[4,5]。

2009 年，由一种新型的病毒感染引起基内雷特湖（Kinneret Lake）的罗非鱼大量死亡，该病毒被命名为罗湖病毒（Tilapia lake virus，TiLV），这种病毒通过水源等介质传播[3,6]。2014 年，Marina Eyngo 等[6]通过cDNA 筛选文库法确定了罗湖病毒（TiLV）的特异性序列（GenBank:KJ605629），长度为1 326 bp，在GenBank 的核酸序列数据库中未发现同源性序列的存在。

近年来，这种新出现的RNA 病毒，使以色列、厄瓜多尔和埃及等国家养殖的罗非鱼大面积死亡[6-8]。2015 年后泰国也大面积感染[9]。2017 年6月，我国台湾地区、海南文昌地区也检测出大量阳性样本，罗非鱼养殖业遭到重创[10]。

鉴于该病毒危害的严重性，全国水产技术推广总站要求各级部门应加强对罗湖病毒病的监测，尤其是养殖场在采购罗非鱼苗种时，一定要加强对苗种的检验检疫，从源头上控制罗湖病毒的爆发。Notomi于2000年发明了LAMP（Loop-mediated isothermal amplification）检测技术，通过对目标基因的6 个区域，设计4 对特异性引物，利用高活性的链置换DNA 聚合酶（Bst DNA polymerase）在60～65℃的恒温条件下，经过30～60 min 的反应，即可完成病原的检测[11,12]。……