构建模拟人致病位点突变的靶向小鼠Krt14的CRISPR/Cas9系统

岳鹏鹏，黎成钦，农月娟，陈 玲，付 灿，于鸿浩

(桂林医学院 生物技术学院，广西 桂林 541199)

成簇规律间隔短回文重复序列/Cas蛋白9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR-associated 9,CRISPR/Cas9)系统是目前广为使用的基因组编辑系统[1-3]，具有设计简单灵活、打靶高效以及低成本的特点[4]，极大地推动了农业和生物医学等领域的发展[5-6]，同时也为人类遗传病的深入研究提供了可靠的研究手段[7]。

单纯性大疱性表皮松懈症(epidermolysis bullos simplex,EBS)是一种常染色体显性遗传病[8]，也是一种严重的皮肤病。患者皮肤的真皮胶原纤维结构发生改变，皮肤、黏膜的脆性增加，轻微的机械摩擦或外伤可导致皮肤出现大疱性糜烂为特点的皮肤和黏膜机械应激反应[9]。目前该病的分子机制仍不清楚，治愈该病的方法也有待进一步探索[10]。研究表明人KRT14突变是该病主要病因之一。正常人的皮肤内KRT14编码蛋白在表皮基底层和毛囊中表达，是一种重要的结构蛋白——角蛋白(keratins)。KRT14的突变具有高度的遗传异质性，不同突变类型引起的临床症状、临床表现亦不相同。因此，有必要筛查明确的、典型的KRT14强致病突变位点，并将突变位点定位于小鼠基因组上，然后通过CRISPR/Cas9系统对该位点进行打靶，方可建立Krt14突变细胞模型或小鼠动物模型，从而精准的模拟单纯性大疱性表皮松懈症，对深入理解KRT14的致病机制以及探索可行的治疗策略具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

CRISPR/Cas9系统包括两种质粒，分别为单导RNA(single-guide RNA,sgRNA)表达质粒pGL3-sgRNA-PGK-puromycin(addgene #51133)和Cas9表达质粒pST1374-NLS-flag-linker-Cas9(addgene#44758);小鼠胚胎成纤维细胞系NIH 3T3(广州大学周建奎博士惠赠)，实验所需的其他试剂参考已发表的文章[11]。……